Cấu trúc khơng gian Tính chất vật lí Hoạt tính của bromelain a. Hoạt tính phân giải

-
Bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 được thu nhận từ họ bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa. Ở mỗi bộ phận khác nhau thì
bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.
- Bromelain có trong tồn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein để
chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide
[5]
.
-
Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của
bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro
[1]
.
1.3.1 Cấu tạo hoá học - Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác
như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose
[1]
. - Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –
NH
2
là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelain quả, acid amin đầu – NH
2
là alanine
[1]
.
OH OH
OH
OH
OH
OH OH
OH OH
OH OH
CH OH
2
CH OH
2
CH OH
2
OH OH
NHCONH
3
NHCONH
3
NHCOCH
2
C N
CH
CH
2
Fructose
Maltose
Maltose Maltose
Xylose Glucofamine
Hình 1.1: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelain

1.3.2 Cấu trúc không gian

- Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau:
- Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp -
- Gly – Cys – Lys - 4
- Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối - S – S -. Phân tử có dạng hình cầu do có
cách sắp xếp phức tạp.
- Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngồi ra,
trong phân tử còn có các ion Zn
2+
có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc khơng gian của enzyme.

1.3.3 Tính chất vật lí

- Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau:
Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của bromelain thân
Tính chất Ký hiệu
Số liệu
Hằng số sa lắng S s
2.73 Hằng số khuếch tán
D cm
2
s 7.77 x 10
-7
Thể tích riêng phần V mlg
0.743 Độ nhớt bên trong
[ I ] dlg 0.039
Tỷ số ma sát f f
o
1.26 Điểm đẳng điện
pI 9.55
Sự hấp thu A
1 cm
ở 280nm 20.1
Trọng lượng phân tử 32.000
32.100 35.500
: Tính bằng phương pháp sa lắng - khuếch tán : Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong
: Tính bằng phương pháp Archibald

1.3.4 Hoạt tính của bromelain a. Hoạt tính phân giải

- Bromelain có 3 hoạt tính: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở bromelain hơn papain trong đu đủ và ficin trong cây thuộc họ Sung
[1]
.
- Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelain. Bảng 1.2: Hoạt tính phân giải casein của bromelain
Cơ chất Hoạt tính phân giải casein UImg
Bromelain thân Bromelain quả xanh
Bromelain quả chín
5
Casein 7.4
4.0 3.0
- Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn trong quả xanh và quả chín.
- Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelain. Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide BAA của bromelain
Cơ chất Hoạt tính phân giải BAA UImg
Bromelain thân Bromelain quả xanh
Bromelian quả chín BAA
3.7 9.1
7.2
- Qua bảng trên ta thấy bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelain thân và quả chín.
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain
- Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các
yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh
khiết...
- Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố
khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của các chất hoạt hóa…
 Ảnh hưởng của pH
: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt độ,
thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch enzyme…Ví dụ: Khi thu thập bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là NH
4 2
SO
4
thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định ở pH = 4.6 - 5.4. Bromelain đã được tinh sạch một
phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6.0 và pH = 8.0, ổn định ở pH = 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63
º
C. Bromelain có biên độ pH rộng 3 -10, tốt nhất là pH = 5 – 8 tuỳ thuộc vào cơ chất.
 Ảnh hưởng bởi cơ chất : trên những loại cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính
khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papain gấp 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương tự như
papain. Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA Benzoyl-L-Arginine amide, BAEE Benzoyl-L-Arginine ethyl ester thì khả năng thuỷ giải của bromelain yếu hơn
papain.
6
 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ : nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều
yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ ít nhiều ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme. Ví dụ: Ở dịch chiết quả dứa
pH = 3.5 khi tăng nhiệt độ lên đến 60
º
C thì bromelain vẫn còn hoạt tính nhưng nếu tăng cao quá thì bromelain sẽ mất hoạt tính. Ở 5
º
C, pH = 4 - 10 thì enzyme giữ hoạt tính tối đa trên casein trong 24h. Ở 55
º
C, pH = 6.1 thì enzyme mất 50 hoạt tính trong vòng 20 phút.
 Ảnh hưởng bởi các ion kim loại : các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của
enzyme do chúng gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme. Chẳng hạn muối thuỷ ngân có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain và mức độ kìm hãm tuỳ
thuộc vào nồng độ của muối.
7
CHƯƠNG 2 NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN
- Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng ngàn chế phẩm enzyme bán trên thị
trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ biến như
amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase…
- Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, như trong công nghiệp thực phẩm, dệt may,
thuộc da…

2.1 Ứng dụng trong y dược