CHƯƠNG II - HÌNH THÁI HỌC VI KHUẨN (9 tiết)

3.Kính hiển vi điện tử

Tất cả các bộ phận được đặt trong một trụ kính và tạo chân không bằng một bơm hút.

Trong chân không, hoạt động của điện tử không bị cản trở.

Các điện tử bắn xuyên qua mẫu vật, được các vật kính và thị kính bằng từ trường làm

tản rộng ra (phân kỳ), sau cùng hiện lên màn huỳnh quang có bộ máy chụp ảnh để chụp khi

cần.

Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào, chúng có kích thước thay đổi tùy từng loài,

chiều dài từ 0,2-20µm chiều ngang 0,2-8µm, vi khuẩn có hình thái riêng đặc tính sinh học

riêng, một số loại có khả năng gây bệnh cho người, động vật và thực vật, một số có khả năng

tiết ra chất kháng sinh (Bacillus subtillis). Đa số sống hoại sinh trong tự nhiên.

Đa số vi khuẩn có hình thái xác định, hình thái này do màng tế bào quyết định, cá biệt

một số loại không có màng nên hình thái không xác định.



II. Phương pháp làm tiêu bản hiển vi

2.1. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi (giọt ép, giọt treo)

Tiêu bản giọt ép: Dùng phiến kính sạch đã tẩy mỡ, giỏ lên phiến kính một giọt canh

khuẩn hay dung dịch bệnh phẩm, sau đó đậy la men (lá kính) lên, quan sát kính hiển vi quang

học.

Tiêu bản giọt treo: dùng phiến kính có hốc lõm ở giữa, cho lên giữa la men một giọt

canh khuẩn hay dung dịch bệnh phẩm, đậy phiến kính lên, sau đó lật ngược phiến kính sao

cho giọt dung dịch treo lơ lửng trong hốc lõm, cho vaselin lên cạnh của la men để chống mất

nước.



12



Sau khi làm tiêu bản soi tươi, quan sát kính hiển vi quang học có thể biết được hình

thái, kích thước, tính chất di động của vi khuẩn, nó cho phép bước đầu phân biệt, nhận dạng

được hình thái của vi khuẩn.

2.2. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm và soi kính hiển vi quang học

Khi quan sát mẫu vật qua kính hiển vi quang học, phần lớn cơ cấu bên trong của vi

sinh vật có chiết suất gần bằng nhau cho nên rất khó phân biệt được. Để có thể quan sát dễ

dàng hơn chúng ta phải nhuộm màu tiêu bản.

Nhuộm vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi quang học là phương pháp không thể thiếu

được trong quá trình xét nghiệm vi khuẩn.

Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh vật là các muối và được phân làm hai nhóm: nhóm

màu acid gồm các muối mà ion mang màu là anion (mang điện tích -), và các nhóm base có

ion mang màu là các cation (mang điện tích dương). Ví dụ: sodium + (có tính base), eosinate(có tính acid).

Màu acid vì nó mang màu hợp với một base (NaOH) để cho ra muối màu. Còn màu

base vì ion mang màu có tác dụng như một base, phối hợp với một acid (HCl) cho ra muối

màu.

Một cách tổng quát, màu acid phối hợp chặt với thành phần của tế bào chất của tế bào

còn màu base phối hợp (ăn màu) với thành phần của nhân tế bào (có tính acid).

Một số màu thuốc nhuộm chỉ bao phủ mặt ngoài mẫu vật, được nhuộm do quá trình

hấp thu hoặc nó tan hay kết tủa chung quanh vật được nhuộm.

Nhuộm đơn: là phương pháp nhuộm màu chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm, các loại

thuốc nhuộm thường dùng là methylene blue, crystal violet, fuchsin, với nấm thường dùng

dung dịch Lactophenol cotton blue (nấm bắt màu xanh).

Nhuộm Gram: phương pháp này do Hans Christian J. Gram (1853-1938) là phương

pháp nhuộm màu kép phổ biến trong nghiên cứu vi khuẩn, thường dùng để nhuộm màu của

một số chi vi khuẩn, cũng có những chi không bắt màu. Phương pháp nhuộm màu này cho

phép chúng ta chia vi khuẩn ra làm hai nhóm chính, nhóm vi khuẩn Gram âm và nhóm vi

khuẩn Gram dương, đây là phương pháp quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn.[1]

+Phương pháp nhuộm Gram



13



Đầu tiên cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm màu qua 4 bước:

-Thuốc đầu tiên là dung dịch tím tinh thể (Crystal violet) trong khoảng 1 phút. Rửa

bằng nước.

-Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol (dung dịch cồn Iot 1%) trong 1phút, rửa lại bằng

nước.

-Phủ lên vết bôi dung dịch tẩy màu (metanol 95% aceton 1:1) hoặc cồn 96 0 trong

khoảng 20 giây đến 1 phút, rửa bằng nước,

-Cuối cùng nhỏ lên vết bôi dung dịch fuchsin (đỏ tía) hay safranin (đỏ vàng) để 1 phút

rửa nước, để khô tự nhiên sau đó soi dưới kính hiển vi.

Nhóm vi khuẩn Gram dương có đặc tính không bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu

giữa tím tinh thể và Iod. Kết quả cuối cùng sẽ bắt màu tím. Nhóm vi khuẩn Gram âm bị dung

môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod, do đó sẽ bắt màu thuốc nhuộm bổ

sung, kết quả bắt màu đỏ hồng.

Bằng nhiều phương pháp kỹ thuật nhuộm khác nhau như phương pháp nhuộm đơn,

nhuộm kép.

Nhuộm tiên mao: Đường kính của roi vi khuẩn rất nhỏ nên khó quan sát được ở kính

hiển vi quang học. Để quan sát được cần nhuộm màu đặc biệt. Nguyên tắc, trước hết phủ lên

roi một lớp hóa chất để làm cho roi to ra, hóa chất này giữ màu nhuộm. Hóa chất thường dùng

để phủ lên roi có thể là tannic acid, màu nhuộm có thể dùng pararosanniline.

2.3. Phương pháp quan sát dưới kính hiển vi điện tử

Để quan sát dưới kính hiển vi điện tử, mẫu vật được cắt lát thành những lát cắt thật

mỏng, bề dày dưới 1 µm có thể đạt đến 0,02 µm, mẫu vật cần được nhuộm bằng những chất

ngăn cản điện tử để tạo sự tương phản của ảnh trên màn huỳnh quang. Các hóa chất dùng để

14



nhuộm mẫu là basic lead citrate, hoặc uranyl acetate 1%,... Ảnh do kính hiển vi điện tử cung

cấp có thể quan sát trực tiếp, cũng có thể chụp nhờ bộ phận chụp gắn dưới màn huỳnh quang.

Qua kính hiển vi điện tử ta có thể thấy rõ được các vi cấu trúc bên trong của vi khuẩn.

II. HÌNH THÁI VÀ KÍCH THƯỚC CỦA VI KHUẨN [2]

Vi khuẩn (Bacteria) là những vi sinh vật mà cơ thể chỉ gồm một tế bào, chúng có hình

dạng và kích thước thay đổi tùy theo từng loại, chiều dài khoảng 1-10 µm chiều ngang

khoảng 0,2 - 10 µm. Vi khuẩn có hình thái riêng, đặc tính sinh vật học riêng. Cấu tạo chưa

hoàn chỉnh (chưa có nhân thật) một số có khả năng gây bệnh cho người, động vật, và thực vật,

một số có khả năng tiết kháng sinh (Bacillus subtillis) đa số sống hoại sinh trong tự nhiên.

Dựa vào hình thái bên ngoài của vi khuẩn, người ta chia vi khuẩn ra làm 6 loại hình

thái khác nhau: cầu khuẩn, trực khuẩn, cầu trực khuẩn, phẩy khuẩn, xoắn khuẩn, xoắn thể.

2.1. Cầu khuẩn (Coccus)

Coccus, số nhiều là cocci, từ chữ Hy Lạp là Kokkys (quả mọng), có nghĩa là loại vi

khuẩn này có hình thái giống như quả mọng.

Cầu khuẩn là những vi khuẩn có dạng hình cầu, tuy nhiên có loại không thật giống với

hình cầu, thường có hình bầu dục như lậu cầu khuẩn Neisseria gonohoeae, bắt màu Gram âm

hoặc có dạng hình ngọn lửa nến như Streptococcus pneumoniae, bắt màu Gram dương. Kích

thước của cầu khuẩn thay đổi trong khoảng 0,5 - 1 µm (1 µm =10-3 mm). Tùy theo vị trí của

mặt phẳng phân cắt và đặc tính rời hay dính nhau sau khi phân cắt mà cầu khuẩn được chia

thành các loại sau đây:

a- Đơn cầu khuẩn (Micrococcus):

Thường đứng riêng rẽ từng tế bào một, đa số sống hoại sinh trong đất, nước, không

khí như: M. agillis, M. roseus, M. luteus.

b- Song cầu khuẩn (Diplococcus)

Cầu khuẩn được phân cắt theo một mặt phẳng xác định và dính với nhau thành từng

đôi một, một số loại có khả năng gây bệnh như lậu cầu khuẩn gonococcus.

c-Liên cầu khuẩn

Cầu khuẩn phân cắt bởi một mặt phẳng xác định và dính với nhau thành một chuỗi

dài. Streptococcus lactis vi khuẩn lên men lactic, Streptococcus pyogenes liên cầu khuẩn sinh

mủ.

Trong chi này còn có loại liên song cầu khuẩn, tức là song cầu khuẩn tập trung từng

đôi một thành chuỗi dài.

Liên cầu khuẩn có trong đất, nước không khí, ký sinh trên niêm mạc đường tiêu hoá,

hô hấp của người và động vật, một số loại có khả năng gây bệnh. Chiều dài của liên cầu phụ

thuộc vào môi trường. Trong bệnh phẩm liên cầu xếp thành chuỗi ngắn 6-8 đơn vị, trong môi

trường lỏng 10-100 đơn vị, môi trường đặc hình thành chuỗi ngắn.



15



d- Tứ cầu khuẩn (Tetracoccus )

Cầu khuẩn phân cắt theo hai mặt phẳng trực giao và sau đó dính với nhau thành từng

nhóm 4 tế bào, tứ cầu khuẩn thường sống hoại sinh nhưng cũng có loại gây bệnh cho người và

động vật như Tetracoccus homari.

e- Bát cầu khuẩn (Sarcina)

Cầu khuẩn phân cắt theo 3 mặt phẳng trực giao và tạo thành khối gồm 8, 16 tế bào.

Hoại sinh trong không khí như Sarcina urea có khả năng phân giải ure khá mạnh. Sarcina

putea, Sarcina aurantica.

f- Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus)

Phân cắt theo các mặt phẳng bất kỳ và dính với nhau thành từng đám như hình chùm

nho, hoại sinh hoặc ký sinh gây bệnh cho người và gia súc, nói chung cầu khuẩn không có

tiên mao roi nên không có khả năng di động, khi nhuộm màu đa số cầu khuẩn bắt màu Gram

dương. Đa số sống hoại sinh một số gây bệnh như Staphylococcus aureus - tụ cầu vàng

2.2. Trực khuẩn (Bacillus, Bacterium)

Bacillus (nghĩa rộng)số nhiều là Bacilli, tiếng La Tinh nghĩa là que ngắn.

Bacterium (nghĩa hẹp) số nhiều là Bacteriae từ chữ Hy lạp là Bakterion: que ngắn.

Trực khuẩn là tên chung để chỉ những vi khuẩn có dạng hình que, hình gậy, kích thước

của vi khuẩn khoảng 0,5-1 x 1-4µm, có những chi thường gặp như:



16