Với phương pháp lên men chìm thì các điều kiện như nhiệt độ, pH, chế độ thoáng khí, tốc độ lắc, áp suất thẩm thấu đều có ảnh hưởng nhất định đến quá trình sinh tổng hợp enzyme.

Tinh sạch và xác định tính

chất của chitosanase từ

chủng Bacillus subtilis

TKU007



còn lại có khối lượng 43kDa

và 22 kDa

Được phân lập từ đất ở Đài

Loan, enzyme có khối lượng

là 7, enzyme bền ở nhiệt độ

25-300C, nhiệt độ tối thích

cho hoạt động của enzyme là

ở 370C và bị bất hoạt ở 600c

Hoạt tính tốt nhất của

chitosan và chitosanase được

xác định ở pH từ 4-6. Nhiệt

độ tối thích là 500C. Duy trì

hoạt tính được từ 250C-400C

và bất hoạt ở 700C



Yeon Jin Choi, Eun

jung Kim, Zhe Pion

(2003), Đại học quốc

gia Gyeongsans. Hàn

Quốc



Tinh sạch và xác định tính

San-Lang Wang, pechất của chitosan và

Yi Ye (2007), Đại

chitosanase từ chủng vi

học Tamkang

khuẩn Pseudomonas sp.

TKU015

với việc sử

dụng vỏ tôm như là một

cơ chất

Các chủng vi sinh vật được phân lập, tuyển chọn từ tự nhiên :Môi trường đất,

môi trường nước, từ một số sản phẩm hoặc từ bộ giống có sẵn. Nhiều đề tài nghiên

cứu về điều kiện thu nhận cũng như tinh sạch enzyme và khảo sát các điều kiện phản

ứng cũng như các nhân tố ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme chitosanase được các

nhà khoa học tiến hành. Hơn thế nữa với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học

đặc biệt là sinh học phân tử đã tạo ra các chủng vi sinh vật mới có khả năng sịnh tổng

hợp enzyme có hoạt tính cao. Tuy nhiên hiện nay, phương pháp cải biến di truyền

bằng gây cảm ứng và chọn lọc kinh điển để cải tiến các chủng vi sinh vật đã không

còn hấp dẫn vì tốn thời gian và giá thành lại cao. Việc sử dụng công nghệ DNA tái tổ

hợp không chỉ tạo ra những chủng vi sịnh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao

mà còn tạo ra cho các enzyme đó những đặc tính vượt trội. Như việc tạo ra chủng

Bacillus sp.strain CK4 có khả năng sinh tổng hợp chitosanase chịu nhiệt. Enzyme

chitosan chịu nhiệt này gồm 242 aminoacid, có khối lượng phân từ là 30 kDa. Người

ta nhận thầy chuỗi polypeptide của nó có tới 76% giống chuỗi chitosanase thu nhận từ

Bacillus subtilis. Chitosanase này có khả năng chịu nhiệt, thời gian bán huỷ của nó là

90 phút ở 800C. Nhờ đặc tính này mà nó rất có ích trong công nghiệp.



2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu về enzyme chitosanase ở nước ta cho đến thời điểm hiện nay

còn rất ít, hầu hết các nghiên cứu còn dừng ở những giai đoạn ban đầu mà chưa có

điều kiện đi sâu hơn và còn chậm hơn rất nhiều so với các nước trên thế giới. Hiện nay

ở nước ta mới có một số đề tài nghiên cứu về chitosan:



16



-“ Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces

griceus” (Đại học thuỷ sản nha trang)

-“Biểu hiện và xác định một số đặc tính của chitosanase tái tổ hợp từ vi khuẩn

Bacillus circulans MH-KL” ( Đại Học Bách Khoa Hà Nội)

-“Bước đầu xây dựng quy trình công nghệ enzyme thuỷ phân chitin/chitosan

bằng enzyme chitinase/chitosanase “(Viện Công Nghệ Sinh Học)

-“ Nghiên cứu ảnh hưởng pH lên cấu trúc phân tử enzyme chitosanase từ vi

khuẩn Bacillus circulans MH-KL” (ĐHKHTN-ĐHQGTPHCM)



17



Phần III

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.l. Đối tượng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu giống vi khuẩn Bacillus lícheniformis do bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ

vi sinh - Công nghệ sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội phân lập từ mẫu

nước lấy từ mẫu nước lấy từ suối nước nóng Kênh Gà – Ninh Bình.



3.1.2. Địa điểm

Nghiên cứu đề tài được tiến hành tại bộ môn Hoá sinh – Công nghệ sinh học

thực phẩm - Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.



3.1.3 Vật liệu nghiên cứu

3.1.3.1. Môi trường cấy truyền, hoạt hoá và nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn



Môi trường hoạt hoá và nuôi cấy vi



(môi trường LB-Agar)

Thành phần



khuẩn



Hàm lượng(%)



Peptone

1%

Cao nấm men

0.5%

NaCl

0.5%

Agar

2%

nước cất

pH 8, khử trùng ở 1atm/20-30 phút



pH 8, khử trùng ở 1atm/20-30 phút



3.1.3.2. Môi trường thử hoạt tính của vi khuẩn

Thành phần

Hàm lượng (%)

Agar

2%

Dung dịch chitosan

0.2%

pH 8, khử trùng ở 1atm/20-30 phút



3.2. Phương pháp nghiên cứu

3.2.1. Bảo quản và giữ giống

- Sau khi tiếp nhận, các mẫu giống vi khuẩn được cấy truyền vào môi trường



18



thạch nghiêng và nuôi cấy ở tủ ấm 48 oC để giữ giống. Sau khi các giống đã mọc tốt,

bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 – 4 oC, sau 2 - 3 tuần phải cấy

truyền lại một lần. Bảo quản giống là khâu hết sức quan trọng.



3.2.2. Thử khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn

Bacillus licheniformis

Sử dụng môi trường thử hoạt tính. Cấy chấm điểm trên môi trường thử hoạt tính

để thử hoạt tính sơ bộ. Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác định các mẫu có hoạt tính

bằng cách đổ một lớp mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt đĩa thạch. Vì chitosanase là

enzyme đặc hiệu đối với cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinh

chitosanase ngoại bào sẽ tiết enzyme ra ngoài môi trường để phân giải cơ chất chitosan

tạo nên vòng phân giải trên môi trường. Enzyme có hoạt tính càng cao thì vòng phân

giải càng to, rộng và sáng. Những mẫu giống có hoạt tính chitosanase cao sẽ được

nghiên cứu tiếp ở điều kiện nuôi cấy thích hợp.



3.2.3. Nuôi cấy mẫu giống có hoạt tính

Môi trường nuôi cấy được phân chia vào các bình tam giác vô trùng có thể

tích 250 ml. Cấy mẫu giống đã hoạt hoá (hoạt hóa 1 vòng que cấy trong ống

nghiệm với thể tích môi trường hoạt hoá 5ml) vào môi trường nuôi cấy ở chế độ vô

trùng. Quá trình nuôi cấy được tiến hành trên máy lắc ở chế độ 200 rpm, 48 oC trong

thời gian 1 ngày



3.2.4. Xác định đường kính vòng phân giải của enzyme thô (phương pháp

đục lỗ thạch)

Sau khi dừng nuôi cấy, tiến hành ly tâm để loại bỏ kết tủa, thu dịch nuôi cấy. Dịch

enzyme thu được sẽ được đem đi phân tích hoạt tính enzyme để tiếp tục tuyển chọn ra mẫu

giống có khả năng sinh tổng hợp chitosanase hoạt tính cao.

Đổ môi trường agar – chitosan ra các đĩa petri, để nguội. Dùng dụng cụ đục lỗ

môi trường có đường kính 1cm, đục các lỗ trên đĩa thạch (3 lỗ/đĩa). Hút 50µl dịch nổi

enzyme cho vào mỗi lỗ thạch, để 2h trong tủ lạnh, sau đó đem ủ ở 48 oC, 22h sau đó

quan sát, đo đường kính vòng phân giải của các mẫu, chọn lọc các mẫu có hoạt tính tốt

để nghiên cứu tiếp.



19