Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

thạch nghiêng và nuôi cấy ở tủ ấm 48 oC để giữ giống. Sau khi các giống đã mọc tốt,

bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 – 4 oC, sau 2 - 3 tuần phải cấy

truyền lại một lần. Bảo quản giống là khâu hết sức quan trọng.



3.2.2. Thử khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn

Bacillus licheniformis

Sử dụng môi trường thử hoạt tính. Cấy chấm điểm trên môi trường thử hoạt tính

để thử hoạt tính sơ bộ. Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác định các mẫu có hoạt tính

bằng cách đổ một lớp mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt đĩa thạch. Vì chitosanase là

enzyme đặc hiệu đối với cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinh

chitosanase ngoại bào sẽ tiết enzyme ra ngoài môi trường để phân giải cơ chất chitosan

tạo nên vòng phân giải trên môi trường. Enzyme có hoạt tính càng cao thì vòng phân

giải càng to, rộng và sáng. Những mẫu giống có hoạt tính chitosanase cao sẽ được

nghiên cứu tiếp ở điều kiện nuôi cấy thích hợp.



3.2.3. Nuôi cấy mẫu giống có hoạt tính

Môi trường nuôi cấy được phân chia vào các bình tam giác vô trùng có thể

tích 250 ml. Cấy mẫu giống đã hoạt hoá (hoạt hóa 1 vòng que cấy trong ống

nghiệm với thể tích môi trường hoạt hoá 5ml) vào môi trường nuôi cấy ở chế độ vô

trùng. Quá trình nuôi cấy được tiến hành trên máy lắc ở chế độ 200 rpm, 48 oC trong

thời gian 1 ngày



3.2.4. Xác định đường kính vòng phân giải của enzyme thô (phương pháp

đục lỗ thạch)

Sau khi dừng nuôi cấy, tiến hành ly tâm để loại bỏ kết tủa, thu dịch nuôi cấy. Dịch

enzyme thu được sẽ được đem đi phân tích hoạt tính enzyme để tiếp tục tuyển chọn ra mẫu

giống có khả năng sinh tổng hợp chitosanase hoạt tính cao.

Đổ môi trường agar – chitosan ra các đĩa petri, để nguội. Dùng dụng cụ đục lỗ

môi trường có đường kính 1cm, đục các lỗ trên đĩa thạch (3 lỗ/đĩa). Hút 50µl dịch nổi

enzyme cho vào mỗi lỗ thạch, để 2h trong tủ lạnh, sau đó đem ủ ở 48 oC, 22h sau đó

quan sát, đo đường kính vòng phân giải của các mẫu, chọn lọc các mẫu có hoạt tính tốt

để nghiên cứu tiếp.



19



3.2.5. Chuẩn bị cơ chất chitosan

Cân 2,35g chitosan (>85%) dạng vảy ngâm trong 500ml dung dịch acid acetic

1% trong 48h. Sau đó ly tâm loại bỏ cặn không tan, rồi lên thể tích 1000ml bằng nước

cất. Dùng NaOH 0,1N và HCl 0,1N chỉnh pH của dung dịch chitosan về pH 8, ta được

dung dịch chitosan 0,2%, pH = 8 để sử dụng.



3.2.6. Xác định hoạt tính enzyme chitosanase bằng phương pháp acid

dinitrosalicylic

 Nguyên tắc: Khi enzyme chitosanase thuỷ phân chitosan sẽ tạo các

Oligosaccharide có đầu chứa đường khử D-glucosamine. Phương pháp acid

dinitrosalicylic xác định sự có mặt của nhóm (C = O) trong đường khử, oxy hoá nhóm

aldehyt trong đường, đồng thời 3,5-dinitrosalicylic acid bị khử tạo thành 3-amino,5nitrosalicylic acid trong môi trường kiềm.

CHO-



nhóm COO-



oxh

Khử



3,5 – dinitrosalicylic acid



3-amino,5-nitrosalicylic acid



Sulfite được bổ sung vào phản ứng để hấp thụ oxi hoà tan trong môi trường vì

oxi hoà tan không cần cho phản ứng màu.Theo trình tự phản ứng, một phân tử đường sẽ

phản ứng với 1 phân tử DNS (Wang, 2007).

 Xác định hoạt độ enzyme chitosanase bằng phương pháp acid dinitrosalicylic

(DNS) (Nguyễn Văn Mùi, 2001).

 Nguyên liệu:

•



Tác nhân phản ứng DNS gồm:



o



Dinitrosalicylic acid: 10 g



o



Phenol: 2 g



o



Sodium sulfite: 0.5 g



o



Sodium hydroxide: 10 g



o



Thêm nước cất đến : 1lít



•



Potassium sodium tartrate solution, 40%



•



Tiến hành:



- Cho 3ml DNS + 3ml glucose vào ống nghiệm (đậy kín)



20



- Đun ở 90oC trong 5 - 10phút → dung dịch có màu nâu đỏ

- Thêm 1ml potassium sodium tartrate (Kali natri tartrat) 40% vào phản ứng để ổn

định màu

- Làm lạnh đến nhiệt độ phòng

- Đo độ hấp thụ quang học (Absorbance) ở bước sóng 575nm (A575).

 Dựng đường chuẩn Glucosamine: Pha dãy glucosamine chuẩn từ 0; 0,5;

1,0; 1,5; …9,0; 9,5; 10mg trong 1ml. Cho 3ml dung dịch glucosamine chuẩn vào một

ống nghiệm, thêm 3ml thuốc thử DNS. Đun sôi 90 oC trong 5phút. Thêm 1ml dung

dịch potassium sodium tartrate 40%. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ

quang học ở bước sóng 575nm (A 575). Vẽ đường chuẩn glucosamine với trục tung là

độ hấp thụ quang học A575, trục hoành là nồng độ glucosamine.

 Chuẩn bị mẫu và đo độ hấp thụ quang học của các mẫu enzyme:

Chuẩn bị 2 ống nghiệm, một ống thí nghiệm, một ống đối chứng. Lấy 2ml dịch

enzyme cho vào mỗi ống, ở ống đối chứng cho thêm 100μl dung dịch NaOH 10N để bất

hoạt enzyme. Sau đó, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch chitosan 0,2%. Đặt 2 ống

nghiệm trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50oC trong 30phút. Sau đó, nhỏ 100 μl NaOH 10N

vào ống thí nghiệm để dừng phản ứng. Từ mỗi ống này lấy ra 3ml rồi thêm vào 3ml

DNS, đặt 2 ống nghiệm trong bể ổn nhiệt 90 oC trong 5 - 10phút. Sau đó, nhỏ vào mỗi

ống 1ml dung dịch Kali natri tartrate 40%. Rồi để nguội đến nhiệt độ phòng và đo A575.

- Mỗi mẫu được làm lặp lại 3 lần.

- Kết quả hoạt tính enzyme được tính theo phương trình đường chuẩn.

 Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzyme chitosanase: Một đơn vị hoạt tính

enzyme chitosanase là lượng enzyme cần thiết xúc tác phản ứng thuỷ phân chitosan để

giải phóng ra 1μmol đường khử trong thời gian 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn của

phương pháp phân tích.

Từ định nghĩa ta có công thức tính hoạt tính enzyme chitosanase là:

Hoạt tính = X*4*1000/30*180*2

Trong đó : X là nồng độ glucosamine tính theo đường chuẩn (mg/ml)

4 là tổng thể tích dịch sau phản ứng (2ml dịch enzyme và 2ml dung dịch

chitosan)



21



30 là thời gian phản ứng

180 là khối lượng phân tử glucosamine

2 là thể tích enzyme trong phản ứng.



3.2.7. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của mẫu

giống vi khuẩn được tuyển chọn

3.2.7.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc

Cấy trang mẫu giống vi khuẩn đã được tuyển chọn lên đĩa thạch chứa môi trường

cấy truyền, sau đó nuôi trong tủ ấm 480C, sau 22h đem quan sát hình thái khuẩn lạc.

3.2.7.2. Quan sát hình thái tế bào

Tiến hành nhuộm Gram, được thực hiện như sau:

- Phiến kính được rửa sạch và làm khô. Nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính,

dùng que cấy lấy một lượng nhỏ vừa đủ tế bào vi sinh vật rồi dàn đều trong giọt nước.

- Hong khô và cố định vết bôi

- Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian 1% hay tím kết tinh (1 – 2 phút), để nghiêng

cho thuốc nhuộm thừa cháy xuổng.

- Nhỏ dung dịch Lugol lên vết bôi (1 – 2 phút)

- Rửa tiêu bản bằng nước và tấy bằng ethanol

- Nhuộm màu bổ sung bằng dung dịch Fuschin 0.1% hay safranin trong 1 – 2

phút.

- Rửa tiêu bản bằng nước, hong khô trong không khí, soi với vật kính dầu.

Trên tiêu bản nhuộm đúng, vi khuẩn G+ bắt màu tím, vi khuẩn G- bắt màu đỏ.



3.2.8. Xác định đường cong sinh trưởng của mẫu giống vi khuẩn Bacillus

licheniformis

Tiến hành nuôi mẫu giống vi khuẩn đã lựa chọn trong môi trường hoạt hoá, ở

480C, lắc 200 rpm. Cứ sau 2h lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp thụ quang học

(Absorbance) ở bước sóng 620nm (A620).



3.2.9. Chọn lựa điều kiện nuôi cấy cho vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme

chitosanase hoạt tính cao



22



Điều kiện nuôi cấy là một yếu tố vô cùng quan trọng giúp cho vi khuẩn sinh

trưởng phát triển, cũng là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Điều

kiện nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môi

trường, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy… Từng điều kiện nuôi cấy riêng rẽ đều có ảnh

hưởng đến hoạt động sống của vi khuẩn. Tìm được giá trị tối ưu của từng yếu tố riêng

rẽ nhưng chưa chắc sự kết hợp của từng yếu tố riêng rẽ đó đã là tìm được điều kiện tốt

nhất cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển, bởi lẽ giữa các yếu tố riêng rẽ đó lại có sự

tác động tương tác lẫn nhau. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành chọn lựa điều kiện của

tổng hợp các yếu tố nuôi cấy cho vi khuẩn. Trong điều kiện có hạn, và căn cứ vào các

tài liệu đã công bố và một thí nghiệm khảo sát về khoảng nhiệt độ, pH, nồng độ cơ

chất chitosan cho sự phát triển của vi khuẩn, chúng tôi tiến hành tìm điều kiện nuôi

cấy gồm ba yếu tố: nồng độ cơ chất chitosan trong khoảng [0.1%; 0.3%], pH môi

trường trong khoảng [7; 9] và nhiệt độ [ 400C; 560C].

Từ phương trình hồi qui có dạng:

Y =b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b11X1X1 + b22X2X2 + b33X3X3 + b12X1X2 +

b13X1X3 + b23X2X3

Trong đó: X1 - biến số mã hoá của biến thực Z1-nhiệt độ nuôi cấy (T0C), khoảng

khảo sát [40-560C], mức tâm: 480C, bước nhảy: 40C.

X2 - biến số mã hoá của biến thực Z2-pH môi trường nuôi cấy, khoảng khảo sát

[7-9], mức tâm: 8, bước nhảy: 1.

X3 - biến số mã hoá của biến thực Z3-nồng độ cơ chất chitosan đưa vào môi

trường nuôi cấy (%), khoảng khảo sát [0.1-0.3%], mức tâm: 0.2%, bước nhảy: 0.1%.

Y – hàm mục tiêu, là hoạt tính enzyme chitosanase (U/ml)

b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23 - các hệ số của phương trình hồi quy

Chúng tôi xây dựng được ma trận qui hoạch thực nghiệm được thể hiện trong Bảng3.



23



Bảng 3.1. Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực

giao bậc 2, ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm)

Thí nghiệm số



Z1 (Nhiệt độ,0C)



1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

 Cách tiến hành:



Z2 (pH)



56.0

40.0

52.0

44.0

52.0

44.0

52.0

44.0

52.0

48.0

44.0

48.0

48.0



8

8

9

7

7

9

8

8

8

9

8

7

8



Z3(Nồng độ cơ

chất, %)

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.3

0.1

0.1

0.1

0.3

0.3

0.2



- Hoạt hóa mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis vào môi trường đã chuẩn

bị theo các công thức đã trình bày.

- Nuôi cấy trong 24h, tốc độ lắc 200rpm.

- Mỗi công thức được lập lại 3 lần.



3.2.10. Phương pháp xác định hàm lượng protein

- Ly tâm dịch nuôi cấy 6000rpm, ở 4 0C, thu dịch enzyme thô. Xác định hàm

lượng protein trong dung dịch enzyme theo phương pháp Bradford (Nguyễn Văn Mùi,

2001).

Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G250 liên kết với protein trong dung dịch acid. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm

Coomassie Brilliant Blue G-250 có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với

các protein tương tác với nhóm kị nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử

protein. Trong môi trường của các gốc mang điện tích dương, sự proton hoá không xảy ra

và có màu xanh xuất hiện.

 Cách pha Coomassie Brilliant Blue G-250: Hoà tan 100mg Coomassie

Brilliant Blue G-250 trong 50ml cồn 95%. Bổ sung 100ml acid phosphoric 85% và 450ml



24



nước cất. Lọc dung dịch bằng giấy lọc, bổ sung 100ml glycerine. Đưa thể tích lên 1000ml.

Sử dụng sau 24h.

 Tiến hành:

+ Ống thí nghiệm: 0,1ml dung dịch protein cần xác định, thêm 5ml dung dịch

thuốc nhuộm protein, trộn đều.

+ Ống đối chứng: 0,1ml dung dịch NaCl 0,15M, thêm 5ml dung dịch thuốc

nhuộm protein, trộn đều.

+ Đem đo A ở bước sóng 595nm (A595) sau 2 phút đến 1h.

Mỗi mẫu được làm lặp lại 2 lần.

+ Tính hàm lượng protein của mẫu thí nghiệm theo đường chuẩn.

 Dựng đường chuẩn protein:

Pha dãy protein từ 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6mg/ml. Tiến hành phản ứng với CBB G-250

theo thứ tự đã trình bày. Đo độ hấp phụ quang ở bước sóng 595nm (A595).



3.2.11. Thu nhận enzyme thô

3.2.11.1. Loại sinh khối của dịch nuôi cấy

Sau quá trình nuôi cấy vi khuẩn kết thúc, tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc

độ 6000 rpm ở 40C. Enzyme chitosanase là enzyme ngoại bào nên loại bỏ kết tủa và

thu lại phần dịch trong.

3.2.11.2. Cô đặc dung dịch enzyme thô

Dịch enzyme thô thu được sẽ được chia đều vào các bình thuỷ tinh rồi để đóng

đá qua đêm. Sau đó tiến hành cô đặc dịch enzyme bằng phương pháp sấy đông khô.

Phương pháp này không gây ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme do được thực hiện ở

nhiệt độ rất thấp (-500C)

3.2.11.3. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn cồn

Tiến hành tủa phân đoạn bằng cồn ethylic lạnh. Cồn làm mất vỏ hydrat bao

quanh các phân tử protein, làm cho các phân tử protein đông tụ lại với nhau dưới dạng

tủa. Làm lạnh cồn tuyệt đối, làm lạnh dung dịch enzyme cần tủa. Lấy 200 ml dung

dịch enzyme cô đặc đến 50 ml cho vào cốc thuỷ tinh, cho từ từ 30 ml cồn đã làm lạnh

vào dung dịch enzyme này, khuấy đều, lại làm lạnh 15 - 30 phút. Sau đó, ly tâm lạnh ở

tốc độ 6000v/ph trong 15phút, thu cặn tủa. Đánh dấu phân đoạn tủa 0 - 30%. Cặn thu



25



được hoà tan trong đệm phosphate pH 6,0 ta được dịch enzyme phân đoạn 0 - 30%.

Còn dịch trong thu được tiếp tục cho thêm cồn đã làm lạnh để đạt 40% cồn. Tiến hành

tương tự như trên cho đến phân đoạn 80 - 90%. Các tiểu phần thu được tiến hành xác

định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein. Qua kết quả trên ta sẽ xác định được hoạt

tính enzyme cao nhất ở phân đoạn nào.

3.2.11.4. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn amoni sulphat

Canh trường vi sinh vật sau khi nuôi cấy đem li tâm để thu lấy dịch trong. Lấy 200ml

đem cô đặc sau đấy đem cô đặc còn 50ml cho vào cốc thuỷ tinh, sau đó bổ sung muối

amoni sunphat ở các nồng độ khác nhau.

Khối lượng amoni sunphat được tính theo công thức:

M = a.V/1000

Trong đó: V là thể tích enzyme đem kết tủa

a là giá trị tra bảng khối lượng được trình bày ở phần phụ lục

Thời gian kết tủa 30 phút, trên máy khuấy từ ở 0 0C. Trong quá trình cho muối

vào phải cho từ từ để tránh hiện tượng biến tính protein cục bộ, sau đó cho enzyme

vào tủ lạnh để qua đêm, sau đó đem li tâm thu tủa ở 40C, vận tốc 9000 vòng/phút trong

30 phút. Tủa thu được đem hoà tan trong đệm axetat 0,2M pH = 5. Xác định hoạt tính

enzyme và hàm lượng protein ở các phân đoạn.



3.2. 12. Phương pháp thống kê và xử lí kết quả

Các kết quả thu được sẽ được xử lí bằng phần mềm Excel, SAS, NEMRODW.



26



Phần IV

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase của mẫu giống vi khuẩn

Bacillus licheniformis

Chúng tôi tiến hành cấy chấm điểm trên môi trường thử hoạt tính để thử hoạt

tính sơ bộ. Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác định các mẫu có hoạt tính bằng cách đổ

một lớp mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt đĩa thạch. Vì chitosanase là enzyme đặc

hiệu đối với cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinh chitosanase ngoại

bào sẽ tiết enzyme ra ngoài môi trường để phân giải cơ chất chitosan tạo nên vòng

phân giải trên môi trường. Enzyme có hoạt tính càng cao thì vòng phân giải càng to,

rộng và sáng.

Qua quá trình xác định hoạt tính của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis

trên môi trường thử hoạt tính, chúng tôi thấy vòng phân giải cơ chất rộng và sáng

chứng tỏ mẫu giống vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase cao.

Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định hoạt tính của mẫu giống vi khuẩn này và

so sánh với các chủng giống vi khuẩn khác bằng cách sử dụng phương pháp đục lỗ

thạch để thử hoạt tính enzyme chitosanase.



Hình 4.1: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống vi

khuẩn Bacillus licheniformis

Sau khi tiến hành hoạt hoá, nuôi cấy mẫu vi khuẩn trên, chúng tôi ly tâm dịch nuôi



27



cấy để loại bỏ kết tủa, thu dịch nuôi cấy có chứa enzyme thô của từng mẫu. Các mẫu

enzyme thô này được thử hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ thạch được tiến hành như

sau: đổ môi trường agar – chitosan ra các đĩa petri, để nguội. Dùng dụng cụ đục lỗ môi

trường có đường kính 1cm, đục các lỗ trên đĩa thạch (3 lỗ/đĩa). Hút 50µl dịch nổi

enzyme cho vào mỗi lỗ thạch, để 2h trong tủ lạnh, sau đó đem ủ ở 48oC, 24h.

Kết quả được trình bày ở Bảng 4.1 và Hình 4.2.



Bảng 4.1: Hiệu số đường kính vòng phân giải của enzyme chitosanase từ

mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis và các giống vi khuẩn khác

Mẫu



DC1



Hiệu số đường kính vòng

Phân giải của Chitosanase (cm)



4DC



HC5



3.0



2.6



2.8



Bacillus

licheniformis

3.5



Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy hoạt tính của enzyme chitosanase của mẫu giống vi

khuẩn Baccilus licheniformis là cao so với các mẫu giống vi khuẩn khác đã từng được

nghiên cứu. Những mẫu giống vi khuẩn như DC1, 4DC, HC5 thì hiệu số đường kính

vòng phân giải của chitosanase chỉ vào khoảng 2,5-3cm, còn giống vi khuẩn Bacillus

licheniformis hiệu số đường kính vòng phân giải đạt 3.5cm.



Hình 4.2: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống

Bacillus licheniformis



28