Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

cấy để loại bỏ kết tủa, thu dịch nuôi cấy có chứa enzyme thô của từng mẫu. Các mẫu

enzyme thô này được thử hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ thạch được tiến hành như

sau: đổ môi trường agar – chitosan ra các đĩa petri, để nguội. Dùng dụng cụ đục lỗ môi

trường có đường kính 1cm, đục các lỗ trên đĩa thạch (3 lỗ/đĩa). Hút 50µl dịch nổi

enzyme cho vào mỗi lỗ thạch, để 2h trong tủ lạnh, sau đó đem ủ ở 48oC, 24h.

Kết quả được trình bày ở Bảng 4.1 và Hình 4.2.



Bảng 4.1: Hiệu số đường kính vòng phân giải của enzyme chitosanase từ

mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis và các giống vi khuẩn khác

Mẫu



DC1



Hiệu số đường kính vòng

Phân giải của Chitosanase (cm)



4DC



HC5



3.0



2.6



2.8



Bacillus

licheniformis

3.5



Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy hoạt tính của enzyme chitosanase của mẫu giống vi

khuẩn Baccilus licheniformis là cao so với các mẫu giống vi khuẩn khác đã từng được

nghiên cứu. Những mẫu giống vi khuẩn như DC1, 4DC, HC5 thì hiệu số đường kính

vòng phân giải của chitosanase chỉ vào khoảng 2,5-3cm, còn giống vi khuẩn Bacillus

licheniformis hiệu số đường kính vòng phân giải đạt 3.5cm.



Hình 4.2: Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu giống

Bacillus licheniformis



28



Để khẳng định chắc chắn mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh ra enzyme

chitosanase có hoạt tính cao, chúng tôi tiếp tục xác định hoạt tính enzyme chitosanase

bằng phương pháp acid dinitrosalicylic của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis,

đồng thời so sánh hoạt tính enzyme chitosanase với 3 mẫu giống DC1, 4DC, HC5 ( là

những mẫu giống đã được nghiên cứu để thu nhận enzyme chitosanase ).

Enzyme thô của các mẫu giống vi khuẩn này được chuẩn bị và tiến hành xác

định hoạt tính như đã mô tả trong phần phương pháp. Kết quả được trình bày trong

Bảng 4.2 và Đồ thị 4.1



Bảng 4.2: Hoạt tính chitosanase của các mẫu được nghiên cứu

Mẫu



Hoạt tính (U/ml)



Bacillus licheniformis



1.23



DC1



1.10



4DC



1.05



HC5



0.89



Đồ thị 4.1: Hoạt tính chitosanase của 4 mẫu được nghiên cứu



29



Qua Bảng 4.2 và Đồ thị 4.1 cho thấy mẫu giống vi khuẩn có hoạt tính enzyme

chitosanase cao nhất là mẫu Bacillus licheniformis (1.23 U/ml), tiếp theo là mẫu DC1

(1.10), mẫu 4DC (1.05 U/ml) và mẫu HC5 (0.89 U/ml). Qua tham khảo nghiên cứu

của một số nhà khoa học trên thế giới thì với hoạt tính enzyme chitosanase thô của

dịch nuôi cấy lớn hơn 1U/ml là rất khả quan, ví dụ như hoạt tính của enzyme

chitosanase sinh ra bởi vi khuẩn Bacillus cereus là 1.34 U/ml (Piza và cộng sự, 1999)

… Trên cơ sở kết quả thu được trên, chúng tôi thấy rằng mẫu giống vi khuẩn Bacillus

licheniformis sinh ra enzyme chitosanase có hoạt tính cao, nên chúng tôi quyết định

chọn mẫu giống vi khuẩn này để tiếp tục nghiên cứu.



4.2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus

licheniformis

4.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Sau khi cấy trang mẫu giống Bacillus licheniformis và nuôi ở nhiệt độ 480C

trong 24h, hình thái khuẩn lạc quan sát được như Hình 4.3, Hình 4.4



Bacillus licheniformis

Hình 4.3, 4.4: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn

Bacillus licheniformis

Khuẩn lạc của mẫu giống vi khuẩn Bacillus licheniformis đầu tiên có màu trắng

sau thấy có váng tím trên bề mặt, khuẩn lạc tròn, nhăn, thường mọc thành cụm



30



4.2.2. Đặc điểm hình thái tế bào

Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram, quan sát trên kính hiển vi quang học với độ

phóng đại 100 lần, hình thái tế bào quan sát được như Hình 4.5.



Hình 4.5: Đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn

Bacillus licheniformis

Qua tiêu bản nhuộm Gram, ta thấy tế bào có hình que, bắt màu thuốc nhuộm

safranin (màu tím). Như vậy giống vi khuẩn Bacillus licheniformis là trực khuẩn Gram

(+). Và là loại vi khuẩn có khả năng di động.



4.3. Chọn lựa thời gian tiếp giống và điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng

hợp enzyme chitosanase của vi khuẩn Bacillus licheniformis

4.3.1. Thời gian tiếp giống

Việc xác đinh cong sinh trưởng của vi khuẩn sẽ cho ta biết sự biến đổi của số

lượng tế bào vi sinh vật theo thời gian trong môi trường nuôi cấy tĩnh (tính theo hàm

log) được thể hiện qua các pha, từ đó giúp chúng ta lựa chọn được đâu là thời điểm

tiếp giống thích hợp nhất.

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy mẫu giống vi khuẩn đã lựa chọn trong môi trường

hoạt hoá, ở 480C, tốc độ lắc 200 rpm, cứ 2h lại lấy dịch nuôi cấy đem đo độ hấp thụ

quang học (A620) trong 36h. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.3 và Đồ thị 4.2



31



Bảng 4.3: Sự phát triển của vi khuẩn Bacillus licheniformis theo thời gian

Thời gian (h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36



A620

0.042

0.065

0.104

0.135

0.189

0.358

0.582

0.653

0.866

0.967

1.032

1.105

1.118

1.104

1.1

1.091

1.052

1.042

1.036



32



Đồ thị 4.2: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis

theo thời gian

Qua Bảng 4.4 và Đồ thị 4.2 ta thấy trong khoảng thời gian từ 0-8h, chỉ số A 620

tăng rất chậm do đây là pha mở đầu trong chu kì sinh trưởng và phát triển của vi sinh

vật, giai đoạn này chúng bắt đầu làm quen với môi trường dinh dưỡng. Ở pha mở đầu,

vi sinh vật đạt tốc độ sinh trưởng cực đại nhưng tế bào chưa phân chia nên số lượng tế

bào chưa tăng hoặc tăng không đáng kể. Từ 8-24h, chủng vi khuẩn Bacillus

licheniformis sinh trưởng và phát triển theo luỹ thừa và đạt cực đại ở 24h (A 620 =

1.118), tế bào ở trạng thái động học và được coi là những tế bào tiêu chuẩn. Khoảng

thời gian này chính là pha log của vi sinh vật. Ở pha này, vi sinh vật sinh trưởng phát

triển nhanh nhất, hình thái và đăc điểm sinh lý của vi sinh vật thể hiện điển hình nhất.

Quá trình trao đổi chất mạnh nên sinh khối vi sinh vật và các sản phẩm trao đổi chất

đạt cao nhất ở pha này. Vì vậy trong sản xuất chúng ta nên chú ý đến pha này, tạo điều

kiện thuận lợi nhằm thu được lượng sản phẩm nhiều nhất. Từ 24-30h tốc độ phát triển

bắt đầu chậm lại và số lượng tế bào tương đối ổn định, đây được coi là pha ổn định của

vi sinh vật, vì ở pha này, quần thể vi sinh vật ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào

mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Nguyên nhân của pha ổn định là sự tích luỹ các

sản phẩm trao đổi chất có hại cho vi sinh vật và việc cạn kiệt chất dinh dưỡng. Từ 30h

trở đi, số lượng tế bào của chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis giảm. Đây là pha tử

vong của vi sinh vật. Nguyên nhân của pha này chưa thật rõ ràng nhưng có liên quan

đến điều kiện bất lợi của môi trường cũng như sự cạn kiệt về nguồn dinh dưỡng.

Như vậy, chất lượng giống tốt nhất và thích hợp nhất cho việc tiếp giống vào

môi trường lên men là ở giai đoạn 8-24h (pha log) trên môi trường hoạt hoá hoặc nhân

giống.



4.3.2. Điều kiện nuôi cấy tối ưu

Điều kiện nuôi cấy là yếu tố vô cùng quan trọng giúp cho vi khuẩn sinh trưởng

và phát triển, cũng là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Điều kiện

nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môi trường,

nhiệt độ, thời gian nuôi cấy…. Các yếu tố này có tác động khác nhau đến khả năng



33



sinh tổng hợp enzyme chitosanase. Qua tham khảo một số tài liệu và các thí nghiệm

khảo sát được, chúng tôi nhận thấy yếu tố nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất chitosan là

những yếu tố có ảnh hưởng mạnh hơn cả đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

chitosanase. Trong thực tế, hoạt tính của enzyme chitosanase thu được không chỉ bị

ảnh hưởng bởi từng yếu tố riêng lẻ mà còn bị ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa các yếu

tố với nhau. Vì thế nếu chỉ dựa trên các nghiên cứu rời rạc để đưa ra điều kiện nuôi

cấy tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi khuẩn thì kết quả sẽ

không đạt độ chính xác cao. Do vậy chúng tôi tiến hành qui hoạch thực nghiêm nhằm

lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu để sinh tổng hợp enzyme chitosan từ vi khuẩn

Bacillus licheniformis. Chọn ba yếu tố có ảnh hưởng nhiều nhất đến khả năng sinh

hoạt tính chitosanase của vi khuẩn là nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất chitosan đưa vào

môi trường. Chúng tôi sử dụng phương pháp qui hoạch trực giao bậc hai, cấu trúc có

tâm để đưa ra phương trình hồi qui biểu diễn mối quan hệ định lượng giữa hoạt tính

enzyme chitosanase và ba yếu tố khảo sát.

Các thí nghiệm được tiến hành và kết quả được thể hiện như trong Bảng 4.4



Bảng 4.4. Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực

giao bậc 2, ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm)

Thí

nghiệm số

1

2

3

4

5

6

7

8

9



Z1 (Nhiệt

độ,0C)



Z2 (pH)



56.0

40.0

52.0

44.0

52.0

44.0

52.0

44.0

52.0



8

8

9

7

7

9

8

8

8



34



Z3(Nồng độ

cơ chất, %)

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.3

0.1

0.1



Y (Hoạt tính

Chitosanase

,U/ml)

0.619

0.950

0.581

0.695

0.807

0.570

0.688

0.731

0.910



10

11

12

13



48.0

44.0

48.0

48.0



9

8

7

8



0.1

0.3

0.3

0.2



1.267

0.681

1.412

1.697



Bảng 4.5: Hệ số của phương trình hồi quy

Nom

b0

b1

b2

b3

b11

b22

b33

b12

b13

b23



Coefficient

1.6940

0.0845

0.1767

-0.0253

0.2080

-0.1737

-0.4232

-0.0602

-0.0948

-0.1575

*** mức ý nghĩa 0.001



Signif. %

< 0.01 ***

< 0.01 ***

< 0.01 ***

< 0.01 ***

< 0.01 ***

< 0.01 ***

< 0.01 ***

< 0.01 ***

< 0.01 ***

< 0.01 ***



Từ Bảng 4.5, chúng tôi thấy b2 = 0.1767 đạt giá trị lớn nhất nên pH (biến số X2)

là yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến khả năng sinh enzyme chitosanase của vi khuẩn

Bacillus licheniformis. Tuy nhiên, nhiệt độ (biến số X 2) cũng là yếu tố ảnh hưởng

không nhỏ đến khả năng sinh chitosanase (vì giá trị b 1 = 0.0845 ). Nhưng khi xét đồng

thời cả hai yếu tố thì pH và nồng độ cơ chất chitosan (b 23 = -0.1575) lại gây tác động

mạnh không kém yếu tố pH, nhiệt độ khi xét riêng rẽ. Trong Bảng 4.5 giá trị b3, b22,

b33, b12, b13, b23 mang dấu âm (-) có nghĩa là các yếu tố này thể hiện nghịch biến

với giá trị của Y ( hoạt tính của enzyme chitosanase). Tức là nếu giá trị các biến X 3,

X22, X33, X12, X13, X23 tăng thì hoạt tính của enzyme chitosanase giảm và ngược lại. Giá

trị b1, b2, b11 mang dấu dương (+) có nghĩa là nếu giá trị các biến X 1, X2, X11 tăng thì

hoạt tính của enzyme chitosanase cũng tăng.

Sau khi tính toán kiểm tra các hệ số của phương trình hồi qui và kiểm tra sự

tương thích của phương trình hồi qui với thực nghiệm, chúng tôi thu được phương

trình sau:

Y = 1.6940 + 0.0845X1 + 0.1767X2 – 0.0253X3 + 0.0280X1X1 - 0.1737X2X2 –

0.4232X3X3 – 0.0602X1X2 – 0.0948X1X3 - 0.1575X2X3



35



Từ kết quả thu được trên ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui

hoạch trực giao bậc 2, ba yếu tố (phương án cấu trúc có tâm ). chúng tôi vẽ được ba đồ

thị sau:



Đồ Thị 4.3. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ,0C), X2 (pH) và Y (hoạt tính

enzyme, U/ml).

Trên Đồ thị 4.3, khi cố định yếu tố X3 = 0.2% (nồng độ cơ chất chitosan) và biến

đổi hai yếu tố X1 trong khoảng ( 40 – 560C), X2 trong khoảng (7 – 9) thì hoạt tính

enzyme chitosanase đạt cao nhất là 1.697U/ml tại nhiệt độ 480C, pH = 8.



36



Đồ thị 4.4. Mối quan hệ của X1 (nhiệt độ, 0C), X3 (nồng độ cơ chất chitosan,

%) và Y (hoạt tính enzyme, U/ml).

Trên Đồ thị 4.4, khi cố định yếu tố X2 = 8 (pH) biến đổi hai yếu tố X1 trong

khoảng ( 40 – 560C), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme chitosanase

đạt cao nhất là 1.697U/ml tại 48 0C và nồng độ cơ chất chitosan là 0.2%.



Đồ thị 4.5. Mối quan hệ của X2 (pH), X3 (nồng độ cơ chất chitosan,%) và Y

(hoạt tính enzyme, U/ml).



37



Trên Đồ thị 4.5 khi cố định yếu tố X1 = 48 (nhiệt độ) biến đổi hai yếu tố X2 trong

khoảng ( 7 – 9), X3 trong khoảng (0.1-0.3%) thì hoạt tính của enzyme chitosanase đạt

cao nhất là 1.697U/ml tại pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan là 0.2%.

Từ mặt phẳng trong Đồ thị 4.3, Đồ thị 4.4 và Đồ thị 4.5 và Bảng 4.4, chúng tôi

kết luận rằng khi xét đồng thời cả ba yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất chitosan thì

giá trị Y sẽ đạt cực đại khi X 1 = 48, X2 = 8 và X3 = 0.2. Vậy điều kiện nuôi cấy tối ưu

để vi khuẩn Bacillus licheniformis sinh tổng hợp được enzyme chitosanase có hoạt

tính cao tại 480C, pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan đưa vào môi trường nuôi cấy là

0.2%.



4.4. Thu nhận enzyme chitosanase

4.4.1. Nuôi cấy và thu nhận enzyme

Thực hiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis ở điều kiện nuôi cấy tối ưu

đã chọn lựa được ở trên ( tại 480C, pH = 8 và nồng độ cơ chất chitosan = 0.2), dịch

nuôi cấy được ly tâm loại bỏ cặn và thu lại phần dịch trong chính là enzyme thô. Hoạt

tính chitosanase thu được trong lần nuôi cấy này là 1.780 U/ml.



4.4.2 Cô đặc dịch enzyme thô

Dịch enzyme thô thu được sau quá trình nuôi cấy có nồng độ protein thấp, do

vậy khi thực hiện các bước tinh sạch tiếp theo như tủa phân đoạn bằng cồn hay muối

sẽ khó khăn do phải sử dụng lượng hoá chất lớn và dụng cụ với thể tích lớn…Do vậy

việc cô đặc dịch enzyme thô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho bước tủa phân đoạn sau đó.

Phương pháp được sử dụng là sấy đông khô, phương pháp này khá hiệu quả do quá

trình thực hiện ở nhiệt độ thấp (-500C) nên giảm thiểu bất hoạt enzyme.

Thể tích dịch thô ban đầu là 200ml sẽ được cô đặc còn 50ml (cô đặc 4 lần).

Hoạt tính của enzyme và nồng độ protein được xác định lại. Tuy nhiên, do bị cô đặc

nên nồng độ các chất sẽ tăng lên rất nhiều và kết quả tính được sẽ không phù hợp với

các đường chuẩn glucosamine và đường chuẩn protein đã có, do vậy để đảm bảo độ

chính xác của các giá trị đo chúng tôi quyết định pha loãng dịch cô đặc 4 lần, sau đó

tiến hành theo các phương pháp đã định. Kết quả cô đặc được thể hiện trong Bảng 4.6



38