Kỹ thuật nhận biết GMO

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7608 : 2007



Quy trình kỹ thuật nhận biết GMO bằng phương pháp xác định DNA



Đánh giá DNA



Định lượng DNA



Định tính DNA



Tách DNA



1.DNA thực vật dựa CTAB

2. DNA động vật dựa

phenol/cloroform

3. DNA VSV dựa

phenol/cloroform



 

Đánh

giáchấtlượngvàxácđịnhh

àmlượng DNA

1.PP điệndi (gel

agarose)



Kỹ thuật PCR



Kỹ thuật realtime PCR



-



-



Thiết kế cặp mồi

Chạy PCR

Tách trên gel



Dựng đường chuẩn DNA

gen chuẩn và gen đích



-



Tiến hành realtime-PCR



agarose



2.PP quangphổ (tia UV )



Thông tư quy định quy trình kỹ thuật và định mức kinh tế - kỹ thuật trong phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng

phương pháp phân tích định tính, định lượng axít deoxyribonucleic. Số: 13/2013/TT-BTNMT 21/6/2013



Các phương pháp trong kỹ thuật PCR



PP đặc hiệu Taxon – đích: taxon đích là đơn vị phân loại GMO, đánh

giá sự có mặt, chất lượng và số lượng DNA



PP sàng lọc PCR: phát hiện yếu tố di truyền dựa vào các cặp

mồi đặc hiệu cho vùng ptomoter và terminator



PP nhận dạng cấu trúc đặc thù: phát hiện sự tổ hợp của các trình

tự ADN được đưa vào hệ gen vật chủ



PCR



Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction)











Công bố 10/1985 bởi Kary Mullis

Phản ứng chuỗi trùng hợp/phản ứng khuếch đại

Nguyên tắc: dựa trên tính biến tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA

Trình tự:DNA khuôn => đoạn mồi ( primer) => Nucleotid tự do => E. Polymerase



Máy PCR



Chu kỳ PCR



Phương pháp PCR

1. Giaiđoạnbiếntính: T= 90 - 95 , = 1 – 2 phútđứtliênkết H, tách 2 mạch DNA.







 



2. Giaiđoạngắnmồi : T= 55 - 65, = 30 – 60 giây, mồibắtcạpvớicácmạchđơn DNA khuônđầu 3’.

3. Giaiđoạntổnghợp: T = 70 - 72 , = 30s – vàichụcphút, E. Polymerase hoạtđộnggắnthêmnucleotidvàocuốiđoạnmồi,

cácmồikéodàibắtcặpmạchkhuôntạomạchđơn DNA mới



Các yếu tố cần thiết trong phản ứng PCR



Máy PCR



1



6



DNA khuôn

KT<3kb, tinh sạch



Dung dịch đệm cho PCR

Đảm bảo hoạt động E như

:Tris, MgCL2, KCL



5



2



PCR



Các nuclecotid tự do

dATP, dTTP, dGTP, dTCP

M=50-200µM



 



E. DNA polymerase

vi khuẩn Thermus aquaticus (110)



4



3



Mồi (primer)

Đoạn oligonucleotid ngắn 14-35Nu

Chỉ bắt cặp ở đầu 3’ mạch khuôn



Ưu – nhược điểm của phương pháp PCR







Ưu điểm :



+ thời gian thực hiện nhanh

+ đơn giản và ít tốn kém

+ độ tinh sạch của mẫu không cần cao

+ Có thể nhận biết được gen đột biến do mất đoạn, thêm đoạn, hay đột biến điểm.







Nhược điểm:



+không hoạt động vơí những phân tử DNA có kích thước lớn hơn 3kb

+ dễ bị ngoại nhiễm: mở nắp ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại

+ sự sao chép do Tap polymerase tỷ lệ sai sót khá cao(10000nu E gắn sai 1 nu)



Phương pháp dựa trên cơ sở protein





Nguyên tắc : Protein có thể phát hiện được bằng cách ứng dụng các kháng thể đặc thù. Trong trường hợp

này, một kháng thể đặc thù thường được tạo ra để phát hiện một protein.







Hạn chế : không thể thực hiện được chính xác nếu có nhiều hơn một sinh vật biến đổi gen có biểu hiện

cùng một protein



Kit Bt- express

 Cấu tạo: strip test là màng nitrocellulose bao phủ bởi 1 đầu là wickinh pad và sample pad với 2 line:control

line và test line



Bộ kit Bt - express

Nhúng đầu sample pad ẫu không độtubiếnỵ qua khu vực K1

M vào mẫu.Mẫ cha



Mẫu đột biến



Tạo phức kháng thể- protein



Khi đi qua K1 không tạo phức.



Dòng chất chạy qua test line,Phức sẽ kết hợp với

kháng thể để tạo phức kt-pr-kt làm xuất hiện 1 vạch



Dòng qua test line cũng không tạo phức và không

được giữu lại –không xuất hiện vạch test line



ở test line



K1: khu vực có

chứa kháng thể đặc trưng cho các protein biến tính



Kháng thể ở test line không liên kết với phức không bị



Xuất hiện vạch ở control line do kháng thể ở test



giữ lại sẽ chuyển dịch lên control line bị giữ lại làm xuất



line bị cố định bởi kháng thể của control line



hiện vạch 2-control line