TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.2. Vi khuẩn Pasteurella multocida

2.2.1.



Đặc điểm hình thái



Vi khuẩn P. multocida có dạng hình gậy ngắn, nhỏ, đơi khi có một vài dạng cầu

trực khuẩn hoặc dạng sợi. P. multocida bắt màu rõ ở hai đầu, Gram (-), không di động,

khơng hình thành nha bào. Kích thước vi khuẩn từ 0,6 – 2,5 μm x 0,2 – 0,4 μm.

Kích thước của vi khuẩn thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Khi nuôi

cấy ở nhiệt độ thấp, vi khuẩn có kích thước nhỏ hơn; trong mơi trường có thêm đường

thì vi khuẩn lớn hơn. Hình thái của vi khuẩn có xu hướng khơng ổn định trong q

trình ni cấy, cấy truyền nhiều lần vi khuẩn có dạng hình sợi nhiều hơn. Hình thái

của vi khuẩn còn thay đổi tùy theo sự hình thành của capsule. Các vi khuẩn có capsule

thường có kích thước lớn hơn vi khuẩn khơng có capsule. Vỏ capsule của vi khuẩn

phát triển tốt trong môi trường cơ bản có thêm 0,5% glucose trong điều kiện hiếu khí,

capsule thường khơng phát triển trong mơi trường khơng có đường ở nhiệt độ 280C.

Đặc tính bắt màu của vi khuẩn P. multocida cũng không cố định. Vi khuẩn trong

các bệnh phẩm, các canh khuẩn mới phân lập thường bắt màu lưỡng cực rõ rệt. Cấy

truyền nhiều lần làm giảm đặc tính bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn.

Khuẩn lạc của vi khuẩn có nhiều biến thể, hình dạng và kích thước của khuẩn lạc

phụ thuộc vào thành phần môi trường nuôi cấy. Trên môi trường agar – tryptose có

chứa đường thì khuẩn lạc có kích thước khoảng 1mm (đường kính), hơi lồi ở giữa và

có sắc cầu vồng. Khi nuôi cấy dài hoặc để lâu ở nhiệt độ phòng khuẩn lạc trở nên trắng

hơn, mọc sâu hơn vào mơi trường thạch.



Hình 2.1 Vi khuẩn Pasteurella multocida ni cấy trên môi trường thạch máu

(http://faculty.matcmadison.edu/mljensen/111CourseDocs/111Review/Unit2Revie

ws/haemophilus_answers.html).

4



Nếu nuôi cấy lâu ngày khuẩn lạc sẽ nhớt và dính, khi cấy chuyển liên tục thì

capsule bị mất, khuẩn lạc nhỏ hơn, khơng màu và trong suốt (Rimler, 1992).

Theo Nguyễn Lương (1997) thì khuẩn lạc có tán sắc cầu vồng rất độc và gây

bệnh thể cấp tính, loại khuẩn lạc màu xanh kém độc, thường gặp ở những đàn gia cầm

bị dịch ở địa phương. Vi khuẩn có khuẩn lạc có tán sắc cầu vồng đem ni cấy có thể

cho khuẩn lạc màu xanh, vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh cũng đột biến và sinh khuẩn

lạc màu xám. Màu của khuẩn lạc liên quan đến vỏ nhày. Vi khuẩn có khuẩn lạc tán sắc

màu cầu vồng tách rời từng tế bào hoặc từng đôi, khơng ngưng kết với kháng huyết

thanh. Vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh cũng rời từng tế bào hay từng cặp nhưng cho

ngưng kết với kháng huyết thanh. Khuẩn lạc màu xám chỉ có chuỗi dài vi khuẩn,

khơng vỏ nhày, khơng độc.

2.2.2.



Đặc tính sinh hóa



Pasteurella multocida thuộc loại vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy nghi. Chúng

phát triển trên các môi trường canh dinh dưỡng, thạch máu hoặc thạch huyết thanh,

nhiệt độ thích hợp từ 36 – 380C, pH: 7,2 – 7,8.

Vi khuẩn mọc yếu trên môi trường thạch thường nhưng mọc tốt trên môi trường

thạch máu và thạch huyết thanh (10% huyết thanh thỏ), trên hai môi trường này vi

khuẩn cho khuẩn lạc nhỏ, tròn, trong, để vài ngày khuẩn lạc chuyển sang trắng ngà.

Trên mặt thạch vi khuẩn có thể có 3 dạng khuẩn lạc: dạng bóng láng, xù xì (R), dạng

nhày (M). Dạng thơng thường là dạng S có tính kháng ngun và độc lực cao. Dạng

biến dị M và R có tính kháng ngun và độc lực thấp.

Trên môi trường thạch máu vi khuẩn tụ huyết trùng không gây dung huyết, khuẩn

lạc phát triển mạnh, mặt khuẩn lạc tròn, láng, hơi ướt.

Khi soi dung quang, khuẩn lạc trên thạch có thể có các dạng: Dạng màu vàng da

cam chiếm 2/3 diện tích được gọi là FO (Flourescent Orange) có độc lực cao; Dạng

màu xanh chiếm 2/3 diện tích được gọi là FG (Flourescent Greenish) có độc lực thấp;

Những khuẩn lạc khơng có huỳnh quang được gọi là NF (Not Flourescent), khơng có

độc lực; Nếu ni cấy nhiều lần trên môi trường nhân tạo, khuẩn lạc sẽ chuyển thành

dạng S sang dạng M hoặc R, tính biến dạng này rất lớn. Một đặc điểm đặc trưng của vi

khuẩn tụ huyết trùng là khi nuôi cấy trong môi trường canh dinh dưỡng vi khuẩn sẽ

làm canh trùng đục có mùi tinh dịch.

5



2.2.3.



Sức đề kháng của vi khuẩn Pasteurella multocida



Vi khuẩn Pasteurella multocida bị diệt dễ dàng ở 500C/ 15 phút hoặc 600C/ 10

phút, ánh sáng mặt trời chiếu thẳng cũng diệt được chúng. Dung dịch HgCl2 1/ 5000,

acid phenic 5%, nước vôi 10%, formol 1% đều diệt được vi khuẩn trong 1 – 3 phút.

Crezyl 3%, phenol 0, 5%, diệt vi khuẩn trong vòng 15 phút. Trong đất ẩm thiếu ánh

sáng, giếng nước bẩn có nhiều chất hữu cơ và trong chuồng trại vi khuẩn sống được và

tháng đến một năm, trong xác súc vật chết chúng tồn tại 1 – 3 tháng.

2.3.



Định danh Pasteurella multocida

Theo các tài liệu của FAO và OIE, vi khuẩn P. multocida xác định serotype theo



kháng nguyên capsule (capsule antigens K) gồm 5 serotype capsule A, B, D, E, F và

kháng nguyên thân (somatic antigens O) từ 1 – 16.

Bảng 2.1 Các hệ thống phân loại theo huyết thanh học của vi khuẩn P. multocida

Author



Basis



Types identified



Capsular typing

Carter (1955)



Indirect haemagglutination (IHA)



A, B, C, D



Carter (1961)



IHA



E



Carter (1963)



IHA and passive mouse protection



Excluded type C



Namioka and Murata (1961)



Slide agglutination of fresh cultures A, B, D, E



Rimier and Rhoades (1987)



IHA



F



Somatic typing

Namioka and Murata (1961)



Agglutination of HCI - treated cells 1-11



Namioka and Bruner (1963)

Namioka and Murata (1964)

Heddleston và cs. (1972)



Agar gel precipitation test using 1 - 1-16

hour boiled supematant

(Nguồn: www.aciar.gov.au/system/files/node/2144/MN057+part+2.pdf )



6



 Các kỹ thuật xác định serotype của vi khuẩn Pasteurella multocida:

Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động (IHA): do Carter (1995) đề xuất xác định

các nhóm kháng nguyên capsule đặc hiệu. Carter đã nghiên cứu một số lớn các phân

lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ các động vật khác nhau và nhận thấy các

serotype A và D được phân lập từ gia cầm và một số động vật khác. Trong nghiên cứu

các ký chủ gia cầm và các loài cầm, Roardes và Rimler (1987) cũng phát hiện các vi

khuẩn thuộc về serotype A, B, D và F bằng phương pháp này.

Kỹ thuật khử bỏ lớp capsule bằng một enzyme mucopolysaccharidase: là kỹ

thuật đặc hiệu giám định sơ bộ các serotype A, D, và F theo De Alwis (1992), và đã

xác định Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm thuộc serotype A, D

và F, trong đó phần nhiều là serotype A.

Định type kháng nguyên thân (somatic antigens) được thực hiện bằng kỹ thuật

ngưng kết trong ống nghiệm và kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch. Namioka và

Murata (1961) đã dùng kỹ thuật ngưng kết trong ống nghiệm với kháng nguyên xử lý

bằng HCl đã xác định được 11 kháng nguyên thân, ký hiệu từ 1 đến 11. Heddleston và

Reber (1972), bằng kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch đã chia kháng nguyên

Pasteurella multocida thành 16 serotype ký hiệu từ 1 đến 16.

Do vậy FAO đã quy định việc xác định serotype vi khuẩn P. multocida theo tất

cả các kháng nguyên capsule và kháng nguyên thân. Từ đó có hai hệ thống định type

vi khuẩn Pasteurella multocida được sử dụng phổ biến là: Hệ thống Namioka – Carter

và hệ thống Carter – Heddleston. Theo các hệ thống này thì vi khuẩn Pasteurella

multocida gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm thuộc các serotype 5:A, 8:A, 9:A theo hệ

thống Namioka – Carter, hoặc A:1, A:3 và A:4 theo hệ thống Carter – Heddleston.

Ở Việt Nam chúng ta đang sử dụng hệ thống phân loại Carter – Heddleston và

thấy trên 90% các phân lập Pasteurella multocida gây bệnh ở gia cầm đều thuộc

serotype A:1 (Bảng 2.2).



7



Bảng 2.2 Kết quả định type P. mutocida gây bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam (Phan

Thanh Phượng, 2000)

N0 Tên tác giả

1

2



Năm



Nguyễn Vĩnh phước và 1978

cộng sự

Dương thế long

1995



Nguồn phân lập chủng

vaccine

45 mẫu từ trâu bò chết tại

một số tỉnh phía nam

Tại Sơn La:

Trâu bò chết



Nguyễn Ngã



1996



4



Nguyễn Thanh Phương 1990

Nguyễn Duy Hồng Hà



1990



Nguyễn Xuân Bình



1996



Lê lập



1997



5



Trương Văn Dung



1998



6



Viện thú y gửi chủng

sang CHDC Đức và

Srilanca định type



A, B, D



Lợn chết

Trâu bò chết tại miền Trung

Gà chết tại một số

Bắc

Gà chết tại một số

Nam

Gà chết tại một số

Nam

Gà chết tại một số

Trung



B



B



Gà chết

3



Serotype



A, B, D

B



tỉnh miền

tỉnh miền

tỉnh miền



A:1



tỉnh miền



Trâu bò khỏe mạnh và chết

tại 7 tỉnh phía bắc



A, B, D



Chủng vaccine FgHc lợn



B



Chủng vaccine P52 trâu bò



B



Chủng vaccine IR trâu bò



B



Chủng vaccine Pa1 và

Pa2 THT gà



A:1

D:1 – D:3



Chủng 4T THT

trâu bò: T1 và T2: bò



B:2 – B:6



T3 và T4: trâu



B:2 – B:6



Dê chết



A:1



Gà chết



A:1



8



 Xác định serotype capsule bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

Định type P. mutocida bằng các phương pháp truyền thống hiện nay có một hạn

chế lớn, đó là khó khăn trong việc sản xuất các kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên

capsule và somatic của các serotype khác nhau. Các nhà khoa học chỉ tìm thấy tương

đối dễ dàng các kháng thể kháng kháng nguyên đặc hiệu của các serogroup B và E,

còn đối với các serogroup khác thì rất khó. Hơn nữa chủng khơng có vỏ capsule thì sẽ

khơng định được serotype.

Do đó gần đây, Townsend và cs (1998) đã phát triển kỹ thuật PCR sử dụng cặp

primer được thiết kế từ trình tự của clone 6b (KTT72 và KTSP61) để phân biệt các

chủng serotype B gây ra bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết (HS) với các serotype khác.

Kỹ thuật multiplex PCR đã được Townsend và cs (2001) ứng dụng như một công

cụ nhanh để định serotype capsule A, B, D, E và F dựa trên các primer được thiết kế

theo các trình tự đặc biệt ở các locus sinh tổng hợp capsule của mỗi serogroup. Kỹ

thuật này đã làm sáng tỏ thông tin về các serotype capsule, đồng thời phân biệt rõ giữa

2 serogroup có quan hệ gần là serogroup A và F. Gautam và cs (2004) cũng đưa ra

phương pháp PCR đặc biệt để xác định P. mutocida serogroup A.

Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007) cũng đã có những nghiên cứu về mối

quan hệ giữa serotype A:1 của P. multocida có nguồn gốc từ gia cầm và heo bằng kỹ

thuật PCR định type capsule và REP – PCR.

Một số thí nghiệm trên gene ompH mã hóa cho protein màng ngồi OMP bằng

PCR – RFLP trên các mẫu phân lập từ loài cầm cho thấy 7 thành phần khác nhau sau

khi dùng enzyme (EcoRI, HindIII và CfoI endonucleases) cắt các đoạn gene khuếch

đại ompH 1,2 kb của 4 serotype P. mutocida phân lập được. Qua đó cho phép đánh giá

kỹ thuật PCR – RFLP là một phương pháp typing tiềm năng để nghiên cứu sự xâm

nhiễm của vi khuẩn P. mutocida và dịch tễ học. Những nghiên cứu này cho thấy không

phải chỉ có sự hiện diện của vỏ capsule mà còn có những nhân tố khác cũng cần cho

tính gây độc (Ahmad Reza Jabbari và Majid Esmaelizadeh, 2005).

Năm 1996, Carol A. Lichtensteiger và cs ứng dụng PCR để khuếch đại gene



toxA 846 bp của vi khuẩn P. mutocida gây độc phân lập từ các mẫu lâm sàng biểu

hiện bệnh nhanh chóng và chính xác. Kết quả PCR hồn tồn phù hợp với kết quả thử

nghiệm bằng ELISA và gây chết trên chuột thí nghiệm độc tố.

9



2.4. Vaccine phòng bệnh tụ huyết trùng gia cầm

Theo Nguyễn Mạnh Thắng (2001) giống vi khuẩn Pasteurella multocida chủng

Tg và V được phân lập tại Nam Bộ hiện đang được sử dụng để sản xuất vaccine tụ

huyết trùng vô hoạt phèn chua hoặc nhũ dầu. Giống vi khuẩn tụ huyết trùng gia cầm

chủng Pa1 và Pa2 có nguồn gốc từ Trung Quốc được dùng để kiểm tra hiệu lực

vaccine tụ huyết trùng gia cầm vơ hoạt.



-



Hình 2.2 Vaccine tụ huyết trùng gia cầm

(www.navetco.com.vn).

Đặc tính: Là vaccine vơ hoạt, chế từ vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc



serotype A:1. Vaccine an toàn, tạo đáp ứng miễn dịch tốt.

-



Chỉ định: Dùng để tạo đáp ứng miễn dịch chủ động phòng bệnh tụ huyết trùng



cho gà, vịt, ngan và ngỗng khoẻ mạnh.

-



Thành phần:







Kháng nguyên: Mỗi 1ml vaccine chứa ít nhất 1010 tế bào vi khuẩn Pasteurella



multocida thuộc serotype A:1.





Chất bổ trợ: Dung dịch phèn chua hoặc keo phèn.



2.5. Tổng quan về kỹ thuật PCR và REP – PCR

2.5.1. Kỹ thuật PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân

tử nhằm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp

DNA của tế bào sống. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh

học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền,

nhận dạng vân tay DNA, chuẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác

định huyết thống.



10



 Thành phần phản ứng trong một eppendorf:

- Buffer: Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào

hệ buffer sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng với enzyme

do nhà sản xuất khuyến cáo.

- Enzyme DNA polymerase: Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng DNA

template và kích thước phản ứng PCR.

- Nồng độ Mg2+: Việc tăng nồng độ ion Mg2+ có thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm

không đặc hiệu. Tuy nhiên nếu thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp.

Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA template và

thành phần buffer.

- dNTPs là loại hóa chất kém bền cần lưu ý khi sử dụng và bảo quản. Nên chia nhỏ

lượng dNTPs để giảm số lần làm tan, sử dụng lại. Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of

mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với

việc hiệu chỉnh các yếu tố khác.

- DNA Template và primers.

- Chất khác: Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì có thể sử dụng các chất biến

tính như DMSO, formamide, glycerol, hoặc betaine trong thành phần PCR. Tuy nhiên,

phải kiểm tra độ tương thích đối với enzyme DNA polymerase. Tăng lượng DMSO

trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống. Một số buffer đã có chứa sẵn loading

buffer để có thể điện di ngay sau PCR. Tuy nhiên, độ nhạy của PCR với những buffer

này không cao. Đối với các máy ln nhiệt (thermocycler) khơng có gia nhiệt trên nắp

thì nên bổ xung mineral oil để tránh bay hơi mẫu.

 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

-



Biến tính (denaturation)



Việc tăng nhiệt độ hoặc kéo dài thời gian biến tính có thể làm tăng tính đặc hiệu

của PCR nhưng làm giảm tuổi thọ của enzyme DNA polymerase. Đối với những

enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường sử dụng nhiệt độ biến tính 94°C - 98°C.

Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu và một bước biến tính ngắn trước từng chu

kỳ nhiệt. Đối với các genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến

5 phút. Để làm giảm ảnh hướng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNA

polymerase sau khi biến tính ban đầu. Khi đã tối ưu PCR thì cần giảm tối thiểu thời

11



gian biến tính mỗi chu kỳ để tăng lượng sản phẩm. Thông thường từ 10 giây đến 30

giây. Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt (PCR

machine, thermocylcer) là khác nhau phụ thuộc hãng sản xuất. Một số hệ thống cho

phép thay đổi thông số này khi tối ưu PCR.

-



Bắt cặp (annealing)



Đối với primer dài hơn 22 bp, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động ở Tm thấp nhất +

3°C. Đối với primer nhỏ hơn 22 bp, nhiệt độ bắt mồi thường thấp hơn Tm thấp nhất,

có thể dùng grandient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu

(khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0, 5°C).

-



Kéo dài (extension)



Nhiệt độ kéo dài thường tiến hành ở 72°C. Tuy nhiên, hoạt tính 5'-3' DNA

polymerase vẫn xảy ra ở nhiệt độ 68°C. Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme

DNA polymerase, chiều dài sản phẩm và loại template.



Hình 2.3 Quy trình phản ứng PCR

(http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/genomics/pcr.html).

12



2.5.2. Kỹ thuật REP – PCR

Repetitive – element polymerase chain reaction (REP – PCR) là phương pháp

trực tiếp cho kết quả fingerprinting (PCR fingerprint), sử dụng các cặp primer đặc hiệu

tương ứng với những trình tự DNA lặp lại, có tính bảo thủ cao, phân bố phổ biến trong

hệ gene của vi khuẩn để tạo ra các hình ảnh phân bố DNA riêng cho mỗi lồi vi khuẩn.

Những trình tự khơng mã hóa này ở nhiều copy hiện diện trong bộ gene của phần lớn

các vi khuẩn gram âm và vài vi khuẩn gram dương (Lupski và Weinstock, 1992).

o



Trình tự REP (repetitive extragenic palindromic) 35 – 40 bp, là các đơn vị



palindromic, chứa một loop biến đổi trong cấu trúc stem – loop (Stern và cs, 1984).

o



Trình tự ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus) 124 – 127 bp,



được mô tả ở trung tâm, cấu trúc palindromic bảo thủ (Hulton và cs, 1991).

o



Trình tự BOX 154 bp: gồm có các tiểu phần subunit bảo thủ khác nhau, được



gọi là boxA, boxB, và boxC (Martin và cs, 1992). Chỉ có trình tự của subunit giống

boxA xuất hiện ở vùng bảo thủ cao trong sự đa dạng của vi khuẩn (Versalovic và cs,

1994). Thành phần BOX là trình tự lặp lại đầu tiên được xác đinh ở vi khuẩn Gram

dương (Martin và cs, 1992).

o



Trình tự Polytrinucleotide (GTG)5.

Những trình tự này xuất hiện tại các vị trí riêng biệt, các vị trí rải rác trên nhiễm



sắc thể, có thể hiện diện trong cả hai hướng trên nhiễm sắc thể, và các cặp primer PCR

đã được thiết kế để "read outward" từ các trình tự REP, ERIC, và từ các subunit boxA

của BOX (Versalovic và cs, 1994). Việc sử dụng các primer ở trên và phản ứng PCR

dẫn đến sự khuếch đại các vùng khác biệt trên genome nằm giữa các trình tự REP,

ERIC hoặc BOX. Các protocol tương ứng được gọi tắt là REP – PCR, ERIC – PCR và

BOX – PCR, được gọi chung là REP – PCR (Versalovic và cs, 1991). Các band

khuếch đại có kích thước phân đoạn trên gel matrix tạo ra các trường mẫu fingerprint

giống như “bar code” (Lupski, 1993), và chức năng giống như một tín hiệu đối với các

chủng vi khuẩn cụ thể. Các “bar code” được phân tích bằng chương trình trên máy tính

như GelCompar để phân biệt các chủng vi khuẩn có mối quan hệ gần, để thiết lập mối

quan hệ sinh dòng giữa các chủng và nghiên cứu sự đa dạng của chủng trong sự khác

nhau của các hệ sinh thái (F.J. de Bruijn, 1997).

13



Hình 2.4 Quy trình của REP – PCR genomic fingerprinting

(https://www.msu.edu/user/debruijn/).



Hình 2.5 Phương pháp REP – PCR (Anne M. Ridley, 1998). Trong phản ứng PCR, các

primer rep1 và rep2 sẽ khuếch đại vùng bên trong ngay kề các thành phần lặp lại trong giới

hạn sự kéo dài của Taq polymerase. Sản phẩm PCR được điện di và cho các band kết quả

thực hiện fingerprint. Sự khác nhau về kích thước các band thể hiện sự đa dạng trong khoảng

cách giữa các thành phần lặp lại này.



14