PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mật độ vi khuẩn Vibrio gây nhiễm thí nghiệm là 5x107 tế bào/mL.

Mật độ vi khuẩn thử nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm là 106 tế bào/mL.

Mật độ vi khuẩn thử nghiệm ở quy mô pilot là 105 tế bào/mL.

Bảng 3.1 Danh mục các chủng vi khuẩn thử nghiệm trong nghiên cứu

Mức độ



Ký hiệu



Nguồn gốc phân



Kết quả định



khuẩn lạc



lập



danh



CH104



Cá chẽm hương



Bacillus sp.



+++



CH102



Cá chẽm hương



Flavimonas sp.



+++



+



CH201



Cá chẽm hương



Micrococcus sp.



+++



+



Micrococcus sp.



++



Pseudomonas sp.



+



Micrococcus sp.



+++



T306

T402

PL606



Tôm sú thương

phẩm

Tôm sú thương

phẩm

Ấu trùng tôm sú



phân hủy

AHL



Đối kháng

Vibrio



+++



(+): Thấp; (++): Trung bình; (+++): Cao.



3.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị

Tủ cấy vô trùng (Microflow)

Tủ ấm lắc (Orbital incubator SI 50).

Tủ ấm (Memmert)

Máy quang phổ (SmartSpectTM Plus Spectrophotomete)

Nồi hấp vô trùng (Hirayama)

Máy cất nước hai lần (Hammilton)

Máy bơm nước, máy thổi khí, máy phát điện.

Khúc xạ kế, máy đo pH, nhiệt kế thủy ngân, kính hiển vi.

Bể composite 1 m3 (12 bể) dùng để ương nuôi ấu trùng

Bể composite 8 m3, 3 m3 và 0,5 m3 chứa nước biển

Các khay bằng nhựa chia làm 6 ô

Bộ test amoniac, nitrite (Sera test)

Túi siêu lọc, cây lọc 1 µm, 5 µm

Các dụng cụ khác như cân điện, ống siphon, vợt, thau, xơ nhựa, dây khí, đá bọt.

18



3.2.3. Hóa chất

Kháng sinh phòng nấm và vi khuẩn

Trepflan

Idorin

Glycerol 20%

Hóa chất xử lý nước: Chlorine, KMnO4, EDTA, CaCO3, Formol

Môi trường Thiosunfat-Citrat-Bile-Salt-sucrose (TCBS) kiểm tra Vibrio

Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) kiểm tra vi khuẩn tổng số

Môi trường Tryptone Soy Broth (TSB) nhân giống vi khuẩn thử nhiệm

3.2.4. Thức ăn cho ấu trùng tôm sú

Thức ăn cho ấu trùng tôm: Artemia, tảo khô, thức ăn tổng hợp, vitamin, chống

sốc (ET800).

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Phương pháp đo mật độ quang

Trước khi bổ sung vi khuẩn vào các nghiệm thức thí nghiệm thì phải tiến hành

đo mật độ quang để xác định mật độ vi khuẩn. Vi khuẩn được pha loãng trong nước

biển sạch, khuấy đều huyền phù vi khuẩn. Sau đó, hút huyền phù vi khuẩn cho vào

cuvet và tiến hành đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 600 nm.

Mật độ vi khuẩn (n) được xác định theo công thức:

n = OD600 x 1,02 x 109 x Độ pha lỗng (tế bào/mL)

Thể tích vi khuẩn cho vào mỗi ơ thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm (với

thể tích mỗi ơ là 50 mL) được tính theo cơng thức

Mật độ gây nhiễm x 50 x 103/n (µL)

Thể tích vi khuẩn thử nghiệm bổ sung ở quy mơ pilot tính theo cơng thức:

(Mật độ gây nhiễm x Thể tích bể ương)/mật độ vi khuẩn

3.3.2. Phương pháp xử lí nước

Phương pháp chuẩn bị nước biển cho thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm

Nước biển được thu từ Vũng Tàu được pha đến độ mặn thích hợp cho tôm, tiến

hành lọc qua bông lọc cá cảnh và bông thấm nước để loại bỏ một phần tạp chất, tiếp

theo tiến hành lọc bằng giấy lọc có đường kính 0,2 µm để loại bỏ những vi khuẩn có

kích thước nhỏ hơn. Hấp khử trùng nước biển này ở 121oC trong 20 phút. Để nguội và

bố trí ra khay thí nghiệm.

19



Phương pháp chuẩn bị nước biển cho thí nghiệm ở quy mô pilot

Bể chứa 8m3



Nước biển



Bể chứa 8m3



Bơm qua



Kiểm tra Clo



túi lọc

KMnO4 (5ppm)



Chlorine (30ppm)

Sục khí mạnh (48h)



Bơm



Để lắng tự nhiên, trung hòa



qua



bằng Thiosulfat sodium



túi



25ppm



siêu



Sục khí mạnh (24h)

Để lắng tự nhiên



Cây



Cây



lọc 2



lọc 1



Bơm qua

túi siêu lọc



Bể 0,5m3



lọc

Bể chứa

trong nhà

3m3



Bể ương 1m3 (diệt khuẩn



Kiểm tra



bằng trepflan 0,2 ppm



S‰



trong 24h, trung hòa bằng



pH



EDTA 10ppm)



Nhiệt độ

NH3

NO2

Vi khuẩn tổng số

Vibrio tổng số



Sơ đồ 3.1 Quy trình xử lí nước biển tại Cà Mau cho ương tôm ở quy mô pilot.

3.3.3. Kỹ thuật ương từ Nauplii thành Postlarvae

3.3.3.1. Xử lý và thả ấu trùng Nauplii

Nauplii trước khi đưa vào thả nuôi cần được cân bằng các yếu tố môi trường

(nhiệt độ , độ mặn). Ngâm bao đựng Nauplii vào bể đến khi nhiệt độ nước trong bao và

bể ương nuôi bằng nhau.

Nếu môi trường chênh lệch khơng q lớn có thể thả nauplii vào chậu duy trì sục

khí, lấy nước trong bể ương thêm từ từ cho đến khi nhiệt độ, độ mặn cân bằng nhau.

Xử lý ấu trùng để ngăn ngừa mầm bệnh: tắm ấu trùng trong nước có chứa

formol 200 - 300 ppm. Trong thời gian 30 giây. Thao tác nhanh, gọn, nhẹ nhàng, hạn

chế tối đa đưa ấu trùng ra khỏi môi trường nước. Mật độ thả Nauplii là 100Nauplii/L.

3.3.3.2. Quản lí bể ương ni ấu trùng

Chăm sóc Nauplii

20



Giai đoạn Nauplii dinh dưỡng bằng nỗn hồng nên chưa cung cấp thức ăn. Chỉ

cần sục khí nhẹ, đều, khơng để ấu trùng chìm xuống đáy bể. Thường xuyên quan sát

khi thấy xuất hiện ấu trùng Zoea thì bắt đầu cho ăn

Chăm sóc ấu trùng Zoea 1 , Zoea 2 , Zoea 3

Giai đoạn này ấu trùng có tính ăn lọc liên tục: tảo khô được cho ăn từ giai đoạn

đầu Zoea 1, tăng dần ở cuối Zoea 1 đến Zoea 2 tăng tối đa giai đoạn Zoea 3 và giảm

dần giai đoạn Mysis. Thức ăn công nghiệp 4 – 6 g /ngày (Lansy, Frippak)

Thường xuyên theo dõi bể ương để biết thức ăn thừa hay thiếu để điều chỉnh.

Siphon ngay mỗi khi thấy phân của ấu trùng vón cục chìm ở đáy bể (để tránh ơ nhiểm

mơi trường nước).

Do tính hướng quang và tụ đàn của ấu trùng Zoea nên bể phải thường xuyên

che bạt kínvà sục khí vừa phài.

Giai đoạn Zoae 1 nhạy cảm với mơi trường bên ngồi và mới bắt đầu sử dụng

thức ăn ngoài nên dễ mắc bệnh đường ruột nên dùng định kỳ: TOP 25: 0,5

g/m3/ngày/lần (8h tối), ET 800: 1 g/m3/ngày/lần (8h sáng). Bổ sung trước khi cho ăn

15 - 30 phút

Chăm sóc ấu trùng Mysis

Ấu trùng giai đoạn này có tính bắt mồi chủ động, thức ăn là động vật phù du.

Thức ăn sử dụng nuôi ấu trùng Mysis chủ yếu là Artemia bung dù, lượng thức ăn từ 2 4 g/m3/100.000 ấu trùng/lần (ngày 4 lần xen kẽ với thức ăn tổng hợp). Thức ăn tổng hợp

0,5 - 2 g/m3/lần (4 lần/ngày). Siphon và thay nước 20% giai đoạn Mysis 3

 Chăm sóc hậu âu trùng Postlarvae

Thức ăn tổng hợp 1,5 – 2,5 g/m3/lần (4 lần/ngày) và Artemia nở cho ăn xen kẽ

thức ăn tổng hợp. Sục khí mạnh. Postlarvae 4 siphon thay nước 20 - 40%

3.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi

Ở điều kiện phòng thí nghiệm

Đếm số lượng ấu trùng còn sống sau 24 giờ, 48 giờ sau khi bổ sung vi khuẩn.

Tỷ lệ sống phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng tôm và các tác động khác nhau

của vi khuẩn.

Ở quy mô pilot

Theo dõi các chỉ tiêu vi sinh: vi khuẩn tổng số (tráng đĩa trên TSA), Vibrio

(tráng đĩa trên TCBS) 1 tuần/lần

21



Theo dõi các yếu tố môi trường: Nhiệt độ (hàng ngày), pH (hàng ngày), NH3-N,

NO2-N (1 tuần/lần)

Quan sát dưới kính hiển vi hình thái phát triển của tơm hàng ngày

Đánh giá tỉ lệ sống và tỉ lệ chuyển qua các giai đoạn và chiều dài trung bình của

tơm (đo chiều dài 30 con/bể rồi tính trung bình) ở các nghiệm thức vào cuối thí nghiệm.

3.4. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí trong các khay nhựa, mỗi khay có 6 ơ và mỗi ơ được bố

trí thể tích nước biển vơ trùng là 50 ml. Mỗi nghiệm thức được bố trí trong một khay

lặp lại 6 lần. Mật độ ấu trùng tôm là 10 con/ô. Bổ sung vi khuẩn với mật độ thích hợp.

Khơng cho ăn trong thời gian thí nghiệm. Sục khí nhẹ một lần mỗi ngày sau khi đếm

xong tơm còn sống và loại bỏ tơm chết.

Tơm sau khi thuần

hóa 12 giờ



Đối chứng



Vibrio 1



Vibrio 2



Vi khuẩn 1



Vi khuẩn 1

+ Vibrio 1



Vi khuẩn 1

+ Vibrio 2



Vi khuẩn 2

+ Vibrio 1



Vi khuẩn 2

+ Vibrio 2



Vi khuẩn 3

+ Vibrio 1



Vi khuẩn 3

+ Vibrio 2



Vi khuẩn 2



Vi khuẩn 3



a)



b)



Sơ đồ 3.2 Mơ hình bố trí thí nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm. (a) Đánh giá độ an

toàn của vi khuẩn thử nghiệm; (b) Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio ở điều kiện in vivo.



22



Hình 3.1 Khay ni tơm thực hiện ở điều kiện phòng thí nghiệm Viện Nghiên Cứu

Ni Trồng Thủy Sản II.

Thí nghiệm trên quy mơ pilot

Bố trí tổng cộng hai đợt thí nghiệm. Thí nghiệm được tiến hành trong các bể

composite thể tích 1 m3, trên ấu trùng Nauplii tới PL15. Mật độ 100 Nauplii/lit

Thí nghiệm nhằm khảo sát các chủng vi khuẩn thử nghiệm với 4 nghiệm thức

trên đợt thí nghiệm. Nghiệm thức 1: khơng bổ sung vi khuẩn, xử lí kháng sinh và hóa

chất theo qui trình của trại sản xuất giống. Nghiệm thức 2,3,4 chỉ bổ sung một chủng vi

khuẩn thử nghiệm 2 ngày/lần với mật độ 105 tế bào/mL và không sử sụng kháng sinh.



Sơ đồ 3.3 Mơ hình bố trí thí nghiệm 1 qui mơ pilot (Bố trí hồn tồn ngẫu nhiên).



Sơ đồ 3.4 Mơ hình bố trí thí nghiệm 2 qui mơ pilot (Bố trí hồn tồn ngẫu nhiên).



23



Hình 3.2 Bể ương ấu trùng tơm sú thí nghiệm ở quy mơ pilot tại Phân Viện Nghiên Cứu

Thủy Sản Minh Hải.

3.5. Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu thu thập sẽ được phân tích giá trị trung bình, độ lệch chuẩn. So sánh

sự khác biệt giữa các nghiệm thức thí nghiệm bằng phương pháp one-way ANOVA và

phân hạng áp dụng phần mềm thống kê Statgraphics Plus 5.1 và Excel 2003.



24



Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Khảo sát chủng vi khuẩn thử nghiệm ở điều kiện phòng thí nghiệm

Trong suốt thời gian bố trí thí nghiệm khi theo dõi, kết quả cho thấy rằng hiện

tượng chết thường bắt đầu xảy ra trong vòng 5 đến 6 giờ sau khi bổ sung vi khuẩn

Vibrio. Trong tất cả các nghiệm thức, tôm chết gần như 100% sau 48 giờ do bị stress ở

các điều kiện thí nghiệm và do thiếu dinh dưỡng. Vì vậy chỉ đánh giá tỷ lệ sống của

tôm sau 24 giờ bổ sung vi khuẩn. Dấu hiệu của ấu trùng tôm sú giai đoạn Postlarvae

15 (PL15) chết là toàn thân xuất hiện màu đỏ gạch.

4.1.1. Thí nghiệm xác định chủng Vibrio gây độc

Thí nghiệm 1: nghiên cứu sự ảnh hưởng của chủng Vibrio alginolyticus đối với

tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú. Vibrio alginolyticus được bổ sung vào nghiệm thức với

mật độ là 5 x 107 tế bào/mL.

Bảng 4.1 Tỉ lệ sống trung bình (%) của ấu trùng tơm sú

sau 24 giờ bổ sung vi khuẩn

Nghiệm thức



Lặp lại (n)



Vibrio alginolyticus



6



0 ± 0a



Không vi khuẩn



6



58,3 ± 21,4b



Các giá trị theo sau các chữ cái (a, b) khác nhau thì khác

nhau có ý nghĩa về mặt thống kê độ tin cậy 0,05.



Kết quả bảng 4.1 cho thấy nghiệm thức bổ sung Vibrio alginolyticus thì tỉ lệ

sống của ấu trùng tơm sú là 0% còn đối với nghiệm thức khơng bổ sung vi khuẩn thì tỉ

lệ sống là 58,3%. Kết quả phân tích thống kê (phụ lục 3) cho thấy có sự khác biệt có ý

nghĩa về mặt thống kê giữa nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn Vibrio alginolyticus và

không bổ sung vi khuẩn (P < 0,05). Vậy chủng Vibrio alginolyticus độc đối với ấu

trùng tơm sú.

Thí nghiệm 2: nghiên cứu ảnh hưởng của Vibrio parahaemolyticus đồng thời

khẳng định lại sức tác động của Vibrio alginolyticus lên tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú.

Mật độ vi khuẩn bổ sung 5 x 107 tế bào/mL.



25



Bảng 4.2 Tỉ lệ sống trung bình (%) của ấu trùng tôm sú

sau 24 giờ bổ sung vi khuẩn

Nghiệm thức



Lặp lại (n)



Vibrio parahaemolyticus



6



0 ± 0a



Vibrio alginolyticus



6



0 ± 0a



Không vi khuẩn



6



23,3 ± 17,5b



Các giá trị theo sau các chữ cái (a, b) khác nhau thì khác nhau

có ý nghĩa về mặt thống kê độ tin cậy 0,05.



Qua bảng 4.2, tỉ lệ sống của 2 nghiệm thức có bổ sung Vibrio parahaemolyticus

và Vibrio alginolyticus đều là 0%, nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn cao hơn là

23,3%. Kết quả phân tích thống kê (phụ lục 4) thấy có sự khác biệt giữa nghiệm thức

không bổ sung vi khuẩn và 2 nghiệm thức có bổ sung Vibrio parahaemolyticus và

Vibrio alginolyticus (P < 0,05). Vậy Vibrio parahaemolyticus và Vibrio alginolyticus

đều độc đối với ấu trùng tơm sú.

Thí nghiệm 3: nghiên cứu sự ảnh hưởng của chủng Vibrio vulnificus đối với tỉ

lệ sống của ấu trùng tôm sú. Mật độ vi khuẩn bổ sung là 5 x 107 tế bào/mL.

Bảng 4.3 Tỉ lệ sống trung bình (%) của ấu trùng tơm sú

sau 24 giờ bổ sung vi khuẩn

Nghiệm thức



Lặp lại (n)



Vibrio vulnificus



6



71,7 ± 9,8a



Không vi khuẩn



6



75 ± 16,4a



Các giá trị theo sau các chữ cái (a, b) khác nhau thì khác

nhau có ý nghĩa về mặt thống kê độ tin cậy 0,05.



Từ kết quả bảng 4.3, tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú ở nghiệm thức không bổ

sung vi khuẩn (75%) cao hơn nghiệm thức có Vibrio vulnificus (71,7%). Tuy nhiên kết

quả thống kê (phụ lục 5) cho thấy 2 nghiệm thức trên không có sự khác biệt có ý nghĩa

về mặt thống kê (P > 0,05). Kết luận rằng Vibrio vulnificus không gây bệnh cho ấu

trùng tơm sú ở điều kiện thí nghiệm trên.

Từ ba thí nghiệm trên nhằm xác định Vibrio spp gây độc cho ấu trùng tơm sú

trong điều kiện phòng thí nghiệm đã chọn ra được 2 chủng là Vibrio parahaemolyticus



26