Phương pháp nghiên cứu

trường thạch đĩa, tính số lượng vi sinh vật trên mililit hoặc trên gam mẫu thông qua

số khuẩn lạc phát triển trong các đĩa môi trường.

Cân 10g mẫu hoà với 90ml nước cất vô trùng, đem lắc mẫu ở máy lắc có

tốc độ 250 vũng/Phút trong 1 tiếng. Sau đó, hút 1ml dịch sau lên men, chuyển

sang ống nghiệm thứ nhất có chứa 9 ml nước cất vô trùng, trộn bằng máy voltex.

Lặp lại lần thứ ba, thứ tư… tới nồng độ thích hợp để tỏch cỏc khuẩn lạc. Hỳt

200àl dung dịch đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường đặc hiệu với mỗi

loại vi sinh vật. Trang thật đều trên bề mặt thạch. Đặt vào tủ 30 0C trong 3 ngày

sau đó lấy ra đếm số khuẩn lạc vi sinh vật.

Cách tính số lượng vi sinh vật trong mẫu phân tích

Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml hay 1g mẫu (N) được tính

theo công thức:



N=



∑C / f (n1 - 0,1n2)



∑C - tổng số đếm được trên tất cả các đĩa

n1- số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất)

n2 - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ hai (độ pha loãng tiếp theo)

f - hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1

- Xác định khả năng thủy phân tinh bột (Theo phương pháp của Cowan và

Steel 1990) [15].

Trên môi trường cơ sở (tùy từng loại vi sinh vật), bổ sung với tỷ lệ 1% tinh

bột tan, rồi khử trùng môi trường ở 1atm trong 30 phút. Phân phối 15ml môi

trường cơ sở đã bổ sung tinh bột tan được đun nóng chảy và làm nguội ở 45 0C

vào các hộp Petri vô trùng. Khi môi trường đó đụng và nguội, ta tiến hành cấy

chấm điểm chủng vi sinh vật phân lập được (các chủng vi sinh vật đã được hoạt

hóa) vào giữa hộp Petri. Sau đó dùng giấy vô trùng gói kín các hộp Petri và đem

nuôi cấy ở 30-320C đối với nṍm mụ́c và nấm men, nhiệt độ 37 0C đối với vi



26



khuẩn (nhiệt độ phù hợp tùy thuộc vào từng chủng vi sinh vật), theo dõi sự phát

triển của vi sinh vật. Sau 2- 5 ngày nhỏ thuốc thử Lugol lên vết cấy để quan sát

khả năng phân giải tinh bột. Nếu thuốc thử Lugol không bắt màu quanh vết cấy

tức là vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột.

- Xác định khả năng phân giải xelluloza (theo phương pháp của Ogundero1982 có cải tiến) [15].

Trên môi trường cơ sở (môi trường thích hợp với mỗi loại vi sinh vật), bổ

sung carboxymethylcellulose (CMC) với tỷ lệ 1%, rồi khử trùng môi trường ở

1atm trong 30 phút. Phân phối 15ml môi trường cơ sở đã bổ sung CMC được

đun nóng chảy và làm nguội ở 45 0C vào các hộp Petri vô trùng. Khi môi trường

đó đụng và nguội, ta tiến hành cấy chấm điểm chủng vi sinh vật phân lập được

(các chủng vi sinh vật đã được hoạt hóa) vào giữa hộp Petri. Sau đó dùng giấy

vô trùng gói kín các hộp Petri và đem nuôi cấy ở 30-32 0C đối với nṍm mụ́c và

nấm men, nhiệt độ 370C đối với vi khuẩn (nhiệt độ thích hợp tùy thuộc vào

từng chủng vi sinh vật), từ ngày thứ 3 trở đi (sự hình thành vòng sáng xung

quanh khuẩn lạc tức sinh enzyme cellulase, thời gian quan sát tùy thuộc từng

loại vi sinh vật) quan sát vòng phân giải cellulose được tạo ra quanh vết cấy.

Sau 3- 5 ngày nhỏ ngập thuốc thử dung dịch 1% congo đỏ lên vết cấy và làm

sạch với 0,1M NaCl, sau đó quan sát khả năng phân giải cellulose. Nếu thuốc

thử congo đỏ không bắt màu quanh vết cấy tức là vi sinh vật có khả năng phân

giải cellulose.

- Khả năng phân giải photphat khó tan (TCVN số 6167-1996 : Phân bón vi

sinh vật phân giải hợp chất Photpho khó tan). Khả năng phân giải photphat khó

tan được xác định bằng phương pháp đo vòng phân giải Ca 3(P04)2 trên môi

trường đặc; đó là vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc (đối với trường hợp

cấy điểm) hoặc lỗ thạch (đối với trường hợp khoan lỗ thạch), nơi mà vi sinh vật

phân giải Ca3(P04)2.



27



- Định danh các chủng vi sinh vật theo phương pháp sinh học phân tử

Các chủng vi sinh vật được phân loại đến loài theo phương pháp phân loại

học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự đoạn gien 16s ARN riboxom của các

chủng vi vi sinh vật, so sánh với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gien quốc tế

EMBL bằng phương pháp FASTA 33 để định loại đến loài các chủng vi sinh

vật. Cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự đoạn gien mã hóa 16s ARN riboxom

của chủng E.coli (J01695), tương ứng với các vị trí nucleotit 15-33 (cho mồi

xuôi) và 1548-1532 (cho mồi ngược). Trình tự nucleotit của các chủng nghiên

cứu được giải trình tự trên máy tự động ABI-377 của Hãng Perkin-Elmer (Mỹ),

sau đó được xử lý bằng chương trình SeqEd1.03 và chương trình

AssemblyLIGN 1.9 trong hệ chương trình MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular

Inc.). Mẫu vi sinh vật được phân tích tại Trung tâm Công nghệ Sinh học-Đại

học Quốc gia Hà Nội. Truy cập Ngân hàng Gien bằng chương trình

Entrez/nucleotide/ tìm kiếm các trình tự gien 16s ARN riboxom của vi khuẩn.

So sánh đối chiếu và xử lý số liệu của tất cả các chuỗi bằng chương trình

GENDOC2.5

Các phương pháp xác định thành phần vật lý và hóa học của bã thải trước

và sau khi xử lý

- Xác định độ ẩm ( theo Tiêu chuẩn ngành về phân tích phân bón 10TCN –

302 – 97). Cân chính xác 2- 3g mẫu phân tích trên cân phân tích cho vào chén sấy

mẫu đã được sấy khô tuyệt đối và cõn trờn cân phân tích chính xác 0,0002g. Đặt

chén vào tủ sấy ở nhiệt độ 650C - 700C mở nắp chén trong 2 -3h cho đến khi mẫu

không đổi. Đậy nắp chộn đó sấy khô và đưa vào bình hút ẩm để làm nguội tới nhiệt

độ phũng ( khụng để quá 1h). Cõn chộn đựng mẫu trên cân phân tích chính xác đến

0,0002g. Độ ẩm được tính

E=



m1 − m 2

m



28



m1: Khối lượng chén và mẫu trước khi sấy (g)

m2: khối lượng chén và mẫu sau khi sấy (g)

m: Khối lượng mẫu phân tích (g)

- Xác định pH bằng máy pH metter điện cực thủy tinh [32a]

- Xác định cỏcbon hữu cơ tổng số (OC %) theo Phương pháp Walkley-Black:

Tác động chất hữu cơ với hỗn hợp Kali Bicromat (K2Cr2O7) N/3 trong Axit

Sunfuric (H2SO4) 25N và chuẩn độ Bicromat dư bằng muối Mohr (Ferrous

Sulphate) với chỉ thị màu BDS (Barium Diphenylamine Sulphonate).[32a]

- Xác định đạm tổng số (N%) Phương pháp Kenđan (Kjeldahl): Phá hủy

mẫu bằng Axit Sunfuric, chuyển N hữu cơ về dạng Sunphat Amon (NH4)2SO4, cho kiềm tác động chuyển về dạng NH 3 và được thu vào dung

dịch Axit Boric, chuẩn độ với axit tiêu chuẩn (HCl 0,01N). [32a]

- Xác định lân tổng số (P2O5 %): Sử dụng Axit Pecloric cùng H2SO4 phân

hủy và hòa tan các hợp chất phốtpho trong đất; xác định hàm lượng lân bằng

phương pháp trắc quang (Spectophotometer).[32a]

- Lân dễ tiêu theo Phương pháp Oniani: Chiết rút P trong đất bằng dung

dịch H2SO4 0,1N theo tỷ lệ đất/dung dịch là 1/25; so màu trờn mỏy chiết quang

có chọn lọc ở bước sóng 882 nm.[32a]

- Xác định hàm lượng HCN theo 10TCN 604:2004

- Xác định hàm lượng chất xơ [32a]: Cân 2g mẫu đã được sấy ở 105 0C từ

2 – 3h vào cốc 150ml. Thêm 50ml dung dịch H 2SO4 8% và thêm 5ml nước cất

đun sôi trong 10 phút. Phần còn lại được rửa gạn với nước nóng nhiều lần (5

lần). Thêm nước cất 1000ml, thêm 9ml dung dịch NaOH 30% và đun sôi 10

phút. Rửa gạn nước nóng nhiều lần, chuyển cặn sang giấy lọc đã biết trọng

lượng trước, rửa nhiều lần trên giấy lọc bằng nước nóng. Sấy cặn và giấy lọc

ở 1050C trong vòng 5 – 6h. Tính kết quả



29



X%=



A− B

× 100

C



A: Khối lượng cặn + giấy lọc (g)

B: Khối lượng giấy lọc (g)

C: Khối lượng mẫu đem phân tích (g)

Phương pháp ủ bã thải tinh bột sắn

Nguyên liệu bã sắn được ủ theo phương pháp ủ phân compost. Nguyên liệu

sử dụng được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Nguyên liệu sử dụng trong xử lý bã thải tinh bột sắn

STT



Nguyên liệu



Hàm lượng

(cho 1 tấn bã sắn)



Hàm lượng (cho

50kg bã sắn)



1



Chế phẩm vi sinh vật



200g



10g



2



Rỉ mật



5kg



0,25g



3



Ure



1kg



0,05g



4



Kali



1kg



0,1g



5



Super lân



10kg



0,5g



6



Vôi bột



0,05%



2,5g



Công thức đối chứng: Không bổ sung vi sinh vật.

Công thức thí nghiệm: Có bổ sung vi sinh vật.

Thời gian ủ là 30 ngày. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm pH, nhiệt độ, độ ẩm

(theo 10TCN 302 – 97)

Phương pháp trồng cây

Đề tài tiến hành trồng cải ngọt Tosankan (Brassica integrifolia)



30



Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 công thức thí nghiệm

và nhắc lại 2 lần.

Cải được trồng trong thùng xốp có kích thước 45ì38ì20cm. Mỗi ô thí

nghiệm có 7kg đất và 5g hạt cải.

CTTN 1: Bón 7,75g N: 3,5g P: 1,75g K

CTTN 2: Bón 136g bã thải sau ủ ở công thức đối chứng và NPK tỉ lệ như trên.

CTTN 3: Bón 136g bã thải sau ủ ở CTTN và NPK tỉ lệ như trên.

CTTN 4: Bón 136g phân chuồng ủ hoai (phân gà) và NPK tỉ lệ như trên.

Cỏc ô thí nghiệm được tưới nước hàng ngày, và theo dõi quá trình sinh

trưởng và sự nảy mầm của hạt. Thu hoạch sau 1 tuần gieo hạt. Sau đó xác định

trọng lượng tươi của mỗi ô thí nghiệm và tỉ lệ nảy mầm.

Phương pháp xử lý số liệu:

Số liệu nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm Exell, và IRRISTAT.



31



PHẦN IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thành phần và tính chất của chất thải rắn từ hoạt động chế biến tinh bột

sắn

Qua số liệu khảo sát tại nhà máy Công ty TNHH MTV tinh bột sắn Elmaco

cho thấy trung bình để sản xuất được 1 tấn tinh bột cần 3,5 - 4 tấn nguyên liệu và

7- 8 m3 nước.

Chất thải rắn phát sinh trong quá trình sản xuất chế biến tinh bột sắn bao

gồm:

- Vỏ gỗ và vỏ củ, chiếm khoảng 2 - 3% lượng sắn củ tươi, được loại bỏ

ngay từ khâu bóc vỏ. Phế liệu này có khối lượng lớn, thành phần có chứa HCN.

- Mủ: lượng mủ khô chiếm khoảng 3,5 - 5% sắn củ tươi. Mủ được tách ra

từ dịch sữa, có hàm lượng chất hữu cơ cao (15.00 - 2.000 mg/100g) và xơ

(12.800 - 14.500 mg/100g) nếu không được làm khô ngay thì quá trình phân hủy

sinh học sẽ gây nên mùi rất khó chịu. Lượng tinh bột chứa trong mủ là 51.800 63.000 mg/100g, gấp đôi lượng tinh bột có trong vỏ gỗ và vỏ củ. Mủ được sử

dụng làm thức ăn gia súc.

- Bùn lắng sinh ra từ hệ thống xử lý nước thải.

- Bao bì phế thải.

- Xơ và bã sắn được thu nhận sau khi đã lọc hết tinh bột. Loại chất thải rắn

này chiếm 15 - 20 % lượng sắn tươi, gây ô nhiễm môi trường nếu không được

xử lý kịp thời. Bã thải rắn của ngành sản xuất tinh bột sắn thường được các

doanh nghiệp sản xuất tận dụng làm sản phẩm phụ dưới dạng thức ăn gia súc.

Nguồn thu từ sản phẩm phụ này là không đáng kể, cần có các biện pháp sử dụng

và quản lý bã thải rắn hiệu quả hơn.



32



Chất thải rắn có khối lượng rất lớn. Với công suất 60 tấn tinh bột/ ngày, tải

lượng phần vỏ gỗ chiếm khoảng 4.800 kg ngày, phần vỏ củ 8.000 kg/ngày, bã

sắn nhiều nhất 16.800 kg/ngày.

Do chất thải rắn có chứa thành phần chủ yếu là tinh bột và xenluloza do đó

cần có biện pháp để tập trung xử lý hai thành phần này, nếu không có biện pháp

xử lý thì quá trình chuyển hóa tự nhiên của các chất thải này sẽ gây mùi hôi,

thối, ô nhiễm nguồn không khí, đất và nước ngầm, ảnh hưởng đến sức khỏe

cộng đồng.

Kết quả phân tích 12 mẫu phế thải dạng rắn tại 6 điểm lấy mẫu khác nhau

tại nhà máy thu được kết quả trình bày tại bảng 4.1

Bảng 4.1. Thành phần vật lý và hóa học bã thải

Chỉ tiêu đánh giá



Đơn vị đo



pH



Kết quả

4,3



Độ ẩm



%



85



HCN



mg/kg chất khô



27



Xenluloza



%



38



Tinh bột



%



5



Chất hữu cơ



%



48,02



Nts



%



0,32



Cts



%



52,05



P2O5



%



0,55



Qua kết quả phân tích trên có thể thấy rằng chất thải sau chế biến tinh bột

sắn có pH thấp, độ ẩm cao, HCN cao gây ảnh hưởng tới hoạt động của vi sinh

vật khi ủ. Đặc biệt hàm lượng xenluloza và tinh bột cao đây là những hợp chất

dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển, nếu không xử lý thì quá trình phân hủy tự

nhiên sẽ sinh ra mùi hôi thối, gây ô nhiễm môi trường, và mục tiêu của đề tài là



33