1 Các kĩ thuật nhuộm

11



Kỹ thuật nhuộm band G (G-band): nhuộm band NST bằng thuốc

nhuộm Giemsa sau khi đã xử lý NST bằng Trypsin. Đây là phương pháp

nhuộm được sử dụng rộng rãi để đánh giá các bất thường của NST về số

lượng và cấu trúc.

Kỹ thuật nhuộm band Q (Q-band): nhuộm NST bằng thuốc nhuộm

huỳnh quang. Kỹ thuật cho hiển thị band tương tự như nhuộm band G.

Kỹ thuật nhuộm band R (reverse band, R-band): đòi hỏi phải xử lí NST

bằng nhiệt trước khi nhuộm. Kỹ thuật này cho phép hiển thị các band sáng tối

ngược với phương pháp nhuộm band Q và G tạo thuận lợi cho việc đánh giá

các bất thường ở các đầu cùng của NST.

Kỹ thuật nhuộm band C (C-band): cho phép nhuộm và đánh giá các

vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) của tâm động.

Kỹ thuật nhuộm NOR (nucleolar organizing region): vùng cấu tạo nên

hạch nhân) (NOR stain): cho phép nhuộm các vệ tinh và các cuống ở các NST

tâm đầu.

Kỹ thuật nhuộm band G với độ phân giải cao (high resolution

banding): NST được nhuộm khi đang ở kỳ đầu (prophase) hoặc vào giai đoạn

sớm của kỳ giữa (prometaphase) sau khi xử lí bằng các hóa chất thích hợp, do

đó tổng số band của NST có thể tăng lên đến 800 band cho phép phát hiện các

bất thường nhỏ trong cấu trúc của các NST.

Kỹ thuật FISH (fluorescence insitu hybridization): lai tại chỗ bằng kỹ

thuật huỳnh quang): Một đoạn DNA được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh

quang đặc hiệu với một vị trí trên NST đóng vai trò của một đoạn dò (probe)

đem lai với các NST ở kỳ giữa, giai đoạn sớm của kỳ giữa, kỳ đầu hoặc gian

kỳ rồi sau đó quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Kỹ thuật này thường

được sử dụng để phát hiện các trường hợp xảy ra tình trạng mất đoạn NST,



12



thừa NST hoặc tái sắp xếp NST như chuyển đoạn. Kỹ thuật đòi hỏi tính đặc

hiệu cao của các DNA dò và định định hướng trong chẩn đoán lâm sàng.

Kỹ thuật lập karyotype quang phổ (SKY: spectral karytotype): Đây là

kỹ thuật nhuộm sử dụng sự phối hợp của 5 loại màu huỳnh quang khác nhau.

với 5 màu khác nhau sẽ có thể tạo ra nhiều màu khác nhau cho phép tạo nên

đủ số probe cho 22 NST thường và 2 NST giới tính X và Y. Với kỹ thuật này

mỗi NST sẽ có một dải màu đặc hiệu sau khi sử dụng hệ thống chụp ảnh và

phần mềm xử lí ảnh đặc hiệu sẽ làm cho việc đánh giá các bất thường về số

lượng và một số loại bất thường cấu trúc của NST một cách hiệu quả [7].

2



Danh pháp

Dưới đây là các danh pháp được sử dụng phổ biến trong việc mô tả



NST trong karyotype:

A-G : Các nhóm NST

1-22: Số của các NST

X, Y: Các NST giới tính

/ : Ký hiệu để minh họa trạng thái khảm (vd: 46/47 mô tả cơ thể ở trạng

thái khảm với 2 dòng tế bào 46 và 47 NST.

p : Nhánh ngắn của NST

q : Nhánh dài của NST

del : Mất đoạn (deletion)

dup : Nhân đoạn (duplication)

i : NST đều (isochromosome)

ins : chèn đoạn (insertion)

inv: : Đảo đoạn (inversion)

r : NST hình vòng (ring chromosome)



13



t : Chuyển đoạn (translocation)

ter : Đầu tận cùng (cũng có thể được viết pter hoặc qter để mô tả đầu

tận cùng của nhánh ngắn hoặc nhánh dài).

Dấu (+) hoặc (-) đứng trước số của NST để minh họa hiện tượng thừa

hoặc thiếu NST đó.

1.2. Các dạng rối loạn NST

1.2.1. Bất thường số lượng NST

1



Đa bội

Trong các tế bào sinh dưỡng dưỡng của thể đa bội, bộ NST lớn hơn 2n



do bộ NST được tang một số chẵn hoặc lẻ lần, ví dụ 3n, 4n…

Có 3 cơ chế có thể dẫn đến hiện tượng đa bội:

- Thụ tinh của các giao tử bất thường.

- Sự phân chia bất thường của hợp tử.

- Sự thụ tinh kép hoặc sự xâm nhập của tế bào cực.

2



Lệch bội

Lệch bội là hiện tượng số lượng NST của tế bào tăng lên hoặc giảm đi



một hoặc vài NST so với bộ NST lưỡng bội [8], [9].

Các dạng lệch bội gồm:

- Thể không 2n-2: thiếu cả hai NST của một loại NST nào đó.

- Thể đơn 2n-1: thiếu 1 NST của 1 loại NST nào đó, ví dụ: 45, X.

- Thể ba 2n+1: có thêm một NST thuộc 1 loại NST nào đó.

- Thể đa 2n+2 hoặc 2n+3… có thêm hai hoặc ba NST của cùng 1 loại

NST.

- Thể khảm: trong cùng 1 cơ thể có hai hoặc ba dòng tế bào chứa hai



14



hoặc ba loại karotyoe khác nhau.

1.2.2. Bất thường về cấu trúc

Một số dạng đột biến cấu trúc NST

- Mất đoạn

- Đảo đoạn

- Chuyển đoạn (chuyển đoạn tương hỗ, chuyển đoạn không tương hỗ

và chuyển đoạn hòa hợp tâm)

- Nhân đoạn nhiễm sắc thể

1.3. Vùng dị nhiễm sắc và vùng nhiễm sắc thực

1.3.1. Nhiễm sắc thực

Nhiễm sắc thực là vùng có chất nhiễm sắc đóng gói lỏng lẻo. Khi

nhuộm băng, vùng này bắt màu nhạt. Đây là vùng thường xảy ra hoạt động

phiên mã.

Mặc dù trên vùng này có thể có một số đoạn ADN không hoạt động

phiên mã song tất cả đoạn ADN trên NST có phiên mã thì đều phải ở trạng

thái nhiễm sắc thực [5].



Hình 1.3. Cấu trúc vùng dị nhiễm sắc và vùng nhiễm sắc thực

Nguồn http://www.nature.com/nrm/journal



15



1.3.2. Dị nhiễm sắc

Dị nhiễm sắc là vùng chất nhiễm sắc đóng xoắn chặt chẽ, bởi nó không

được tiếp cận với polymerase nên không được sao chép trong quá trình phiên

mã.

Khi nhuộm băng, dị nhiễm sắc tương ứng với vùng bắt màu đậm,

thường nằm ở gần tâm động hoặc đầu mút của các NST.

Dị nhiễm sắc bao gồm vùng dị nhiễm sắc cố định (constitutive

heterochromatin)



và



vùng



dị



nhiễm



sắc



tạm



thời



(facultative



heterochromatin).

Dị nhiễm sắc cố định là những đoạn NST được đóng gói chặt chẽ ở mọi

tế bào trong cơ thể. Phần lớn những đoạn này gồm ADN có chuỗi nucleotid

lặp đi lặp lại một cách đơn giản. Chúng tạo nên tâm của NST [9].

Dị nhiễm sắc tạm thời là những đoạn NST chỉ đóng gói chặt chẽ ở một

số tế bào trong cơ thể, hoặc ở những giai đoạn nào đó của sự biệt hóa tế bào.

Chúng cũng không được phiên mã, mặc dù ADN ở đây không phải là những

chuỗi lặp lại đơn giản mà có thể chứa các gen thực sự. Tế bào càng biệt hóa

thì tỉ lệ dị nhiễm sắc tạm thời càng lớn, hay nói cách khác càng có nhiều gen

bị khóa lại, không được biểu hiện nữa [10], [11].

1.4. Hiện tượng dị hình nhiễm sắc thể

1.4.1. Những khái niệm cơ bản về dị hình NST

Sau khi NST được xử lý và nhuộm băng, số lượng, vị trí, kích thước

của các băng đặc trưng cho từng NST. Tuy nhiên, người ta quan sát thấy một

số trường hợp có sự thay đổi về độ lớn, độ bắt màu ở vùng dị nhiễm sắc, tính

chất này có thể di truyền từ bố mẹ sang con theo kiểu di truyền Mendel. Đó là

hiện tượng dị hình của NST (heteromorphism) và đôi khi được dùng như một

“marker” đặc trưng cá thể [1].



16



Hình 1.4. Một số dạng NST dị hình

Nguồn http://www.nbs.csudh.edu/chemistry/faculty

Các biến đổi tạo nên tính dị hình NST bao gồm biến đổi về chiều dài,

biến đổi về số lượng hay về vị trí của các khối dị nhiễm sắc [1]. Các biến đổi

này có thể được phát hiện qua soi kính hiển vi khi sử dụng kỹ thuật nhuộm

băng NST. Được nhận định là có biến đổi khi vùng dị nhiễm sắc quan tâm có

sự thay đổi khác biệt so với vùng dị nhiễm sắc tương ứng trên NST tương

đồng. Trong bộ NST người, người ta thường quan sát được sự thay đổi về

kích thước tạo nên các vùng dị hình nổi bật dễ quan sát nhất ở nhánh dài các

NST 1, 9, 16, nhánh ngắn các NST nhóm D và nhóm G, và NST Y. Tăng

chiều dài của vùng dị nhiễm sắc trên nhánh dài NST gồm 1qh+, 9qh+, 16qh+,

Yqh+. Đôi khi các chất dị nhiễm sắc cũng có thể mất đi ở các NST này [12],

[13], [14].

Theo phân loại được đề xuất bởi Patil và Lubs 119.771. Với NST 1, 9

và 16, một NST được định nghĩa là có tang kích thước vùng dị nhiễm sắc

nhánh dài (qh+) khi kích thước vung đó lớn hơn hoặc bằng 2 lần kích thước

cánh ngắn NST 16. NST có giảm kích thước vùng dị nhiễm nhánh dài khi



17



vùng dị nhiễm sắc rất nhỏ hoặc thiếu ở cánh dài. Với NST Y, Yqh+ được định

nghĩa là khi NST Y lớn hơn nhiễm sắc thể 18 và Yqh- khi nhiễm sắc thể Y

nhỏ hơn so với một NST thuộc nhóm G [12].

Nguyên nhân của tính đa hình NST chưa hoàn toàn rõ ràng nhưng được

cho là do sự lặp lại của các đoạn DNA mà không mã hóa gen.

1.4.2. Đặc điểm dị hình của NST ở quần thể người

Những nghiên cứu trước đây cho thấy, tỉ lệ cá thể mang NST dị hình

chung được cho là rơi vào khoảng 2-3% dân số trong quần thể, trong đó

chiếm cao nhất là các 9qh+, 16qh+ và Yqh+/-. Các dạng dị hình 1qh+, nhóm

D và G có tỉ lệ thấp hơn. Tuy nhiên tỉ lệ cá thể mang NST dị hình ở những

quần thể khác nhau là khác nhau [15], [16], [17].

Trong một nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1/2005 đến tháng

1/2007 của Khoa Y đại học Baskent Thổ Nhĩ Kì, các nhà khoa học đã tiến

hành xác định tính dị hình ở 1130 mẫu chọc ối. Tiêu chuẩn được chọn là tất

cả các sản phụ đến bệnh viện khu vực được chỉ định chọc ối theo hướng dẫn

của chẩn đoán tiền sản, ví dụ mẹ cao tuổi, có tiền sử bất thường về di

truyền…. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 20 bào thai trong số trên có NST dị

hình tương ứng với 1,77%, trong đó chiếm tỉ lệ cao nhất là nhóm D (0,53%),

nhóm G ( 0,18%) các dạng còn lại chỉ chiếm 0,36% [18], [19].

Cũng trong nghiên cứu này chỉ ra có sự khác biệt về tỉ lệ NST dị hình

giữa các bào thai nam và nữ. Tỉ lệ NST dị hình ở nam cao hơn ở nữ. Số bào

thai nữ được phát hiện có NST đa hình là 9 (1,65%) với của nam là 11

(1,87%).

Năm 1971, Lubs và Ruddle lần đầu tiên báo cáo một tỷ lệ cao hơn

đáng kể của đảo đoạn gồm tâm của nhiễm sắc thể 9 ở người Mỹ da đen so với

người Mỹ da trắng [10].



18



Trên cơ sở đó, năm 1987 khoa Y đại học New York đã phối hợp với

trung tâm chẩn đoán trước sinh của thành phố để thực hiện một nghiên cứu

lớn về tỉ lệ NST dị hình của NST 1, 9, 16 và Y ở 6250 mẫu ối bao gồm 2334

trường hợp là người da trắng gốc châu Âu, 1737 người gốc Tây Ban Nha,

1795 trường hợp người Mỹ gốc da đen và 384 trường hợp là gốc châu Á. Kết

quả thu được, tỉ lệ cá thể mang NST dị hình là 3,72% song ở nhóm người da

trắng gốc âu tỉ lệ này là 2,18% người gốc châu Á là 3,14% , người gốc Phi

4,79% và người gốc Tây Ban Nha là 4,83%. Kết quả còn cho thấy sự khác

biệt rất quan trọng về tần số của inv (9) trong các nhóm dân tộc khác nhau (p

<0,001, kiểm định Khi bình phương). Inv (9) có tỉ lệ cao hơn ở người da đen

(3,57%), tiếp theo là Tây Ban Nha (2,42%), người da trắng (0,73%), và ở

người châu Á (0,26%) . Cũng trong nghiên cứu này, tỉ lệ Yqh+ có vẻ phổ biến

hơn trong nhóm châu Á mặc dù không có sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm

dân tộc (0,1
và châu Á, nhưng không có sự khác biệt đáng kể (0,05

( 0,67%) chiếm tỉ lệ cao hơn Yqh- (0,57%).

Tỉ lệ của 1qh+/-, 9qh+/- và 16qh+ là tương tự nhau giữa các nhóm

người [4].

1.4.3. Ảnh hưởng của NST dị hình

Gần đây có rất nhiều nghiên cứu về mối liên quan và sự tác động của

tính dị hình NST đối với các trường hợp bất thường sinh sản như vô sinh, sảy

thai, thai chết lưu. Nghiên cứu trên các đối tượng này, người ta nhận thấy tỷ lệ

dị hình NST là cao hơn so với những người bình thường không có tiền sử liên

quan đến sảy thai, thai chết lưu.

Theo Hemlata Purandare và cộng sự (2011) tiến hành nghiên cứu giữa

hai nhóm đối tượng, nhóm thứ nhất gồm 440 cặp có tiền sử sảy thai, thai chết



19



lưu được so sánh với nhóm thứ hai gồm 200 cá nhân bình thường không có

liên quan đến bất thường sinh sản thì nhận thấy trong nhóm thứ nhất, có 75

trường hợp có biến đổi về NST, chiếm 17%. Trong khi đó ở nhóm thứ hai, sự

biến đổi NST chỉ quan sát thấy ở 7 người, chiếm tỷ lệ 3,18%. Như vậy tỷ lệ

tính dị hình NST ở nhóm có tiền sử sảy thai, thai chết lưu cao hơn hẳn so với

nhóm đối tượng bình thường không có các bất thường về sinh sản [20].

Cũng theo một nghiên cứu mới đây của Bronova và cộng sự (2015)

nghiên cứu về tính dị hình NST trên 948 phụ nữ có bất thường sinh sản ở

Slovakia thì thấy 95 trường hợp có biến đổi về NST, chiếm 10,02%, trong khi

ở nhóm đối chứng không có bất thường sinh sản là 3,15% [21].

Trong những biến đổi bình thường ở bộ NST người, người ta nhận thấy

các biến đổi hay xảy ra ở các NST 1, 9, 16 và NST Y. Theo nghiên cứu về

tính dị hình NST ở 221 cặp vợ chồng sảy thai liên tiếp của Akbas năm 2012

thì quan sát được sự biến đổi xảy ra trên các NST số 1, 9, 16, Y và các NST

nhóm D,G, trong đó tăng chiều dài trên nhánh dài NST số 9 (9qh+) hay gặp

nhất, chiếm 37,8% trong số các NST quan sát được có sự biến đổi, tăng chiều

dài nhánh dài NST số 1 (1qh+) chiếm tỷ lệ thấp nhất (2,7%) [2].



20



Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là các thai được làm xét nghiệm nhiễm thể trước

sinh tại Bộ môn Y sinh Học - Di truyền Trường Đại học Y Hà Nội từ tháng 1

năm 2014 đến tháng 12 năm 2015.

2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

* Các thai phụ được chọc ối làm xét nghiệm nhiễm sắc thể trước sinh

theo tiêu chuẩn của chỉ định chọc ối :

- Thai từ 16 tuần trở lên

- Có kết quả bất thường từ một xét nghiệm sàng lọc trước sinh. Bệnh

nhân có kết quả sàng lọc triple test, douple test hay qua siêu âm ở

những tháng trước đó thuộc nguy cơ cao mắc các bệnh di truyền

như Down, Patau…..

- Mẹ đã có một lần mang thai hay sinh con bất thường nhiễm sắc thể.

- Mẹ mang thai ở tuổi trên 35. Trẻ sinh ra phụ nữ 35 tuổi trở lên có

nguy cơ bất thường nhiễm sắc thể, chẳng hạn như hội chứng Down

cao hơn.

- Có tiền sử gia đình liên quan đến một rối loạn di truyền cụ

thể, Ngoài ra để xác định hội chứng Down và tật nứt đốt sống, chọc

dò màng ối có thể được sử dụng để chẩn đoán nhiều điều kiện khác

- chẳng hạn như xơ nang. Ngoài ra chọc dò màng ối còn được thực

hiện nhằm 1 số mục đích y học khác không liên quan đến nghiên

cứu này.



21



* Lựa chọn các bệnh án di truyền có kết quả xét nghiệm NST không có

karyotype đột biến.

2.1.2. Cỡ mẫu

Cỡ mẫu chúng tôi chọn mẫu toàn thể. Trong thời gian nghiên cứu từ

tháng 1/2014 đến tháng 12/2015, chúng tôi thu thập được tổng số n = 1510

mẫu kết quả xét nghiệm NST trước sinh qua chọc ối đủ tiêu chuẩn nghiên

cứu.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu

Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này là mô tả cắt ngang.

2.2.2. Các bước tiến hành

Bước 1: Thu thập bệnh án hồi cứu.

Bước 2: Lựa chọn các bệnh án đạt tiêu chuẩn.

Bước 3: Phân tích tính chất nhuộm băng NST, phát hiện tính dị hình ở

các NST 1, 9, 16, nhóm D, nhóm G và Y.

Bước 4: Nhập kết quả và xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 22.

2.2.3. Kỹ thuật thu thập thông tin

Thông tin được thu thập theo kĩ thuật hồi cứu sử dụng tư liệu có sẵn.

Trong nghiên cứu này, tư liệu chúng tôi sử dụng là kết quả xét nghiệm NST

trước sinh của 1510 mẫu ối thực hiện từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2015 tại

bộ môn Y sinh học di truyền - Trường đại học Y Hà Nội.

Công cụ thu thập số liệu là biểu mẫu thu thập thông tin hồi cứu từ bệnh

án di truyền tại bộ môn Y sinh học di truyền – Trường đại học Y Hà Nội.