3 Tách từng phần và tinh sạch enzyme
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (9.48 MB, 396 trang )
SắC KÝ TRAO ĐổI ION
Có 2 loại gel trao đổi ion: anion (anionit) và cation
(cationit). Gel = gắn nhóm chức tích điện dương
(DEAE, QAE), nhóm chức tích điện âm (CM,SP)
lên chất nền cellulose,sephadex.
Sắc ký trao đổi ion thường được dùng ở mức tinh
sạch ban đầu, phân chia các protein khác nhau về
độ tích điện
E được rửa (eluded) ra khỏi gel nhờ thay đổi nồng
độ muối hay pH của môi trường=>lựa chọn pH để
E cần tinh sạch gắn hay không gắn trên gel: nghệ
thuật tinh sạch và thu nhỏ mẫu nghiên cứu
167
SắC KÝ LọC GEL (SắC KÝ LọC RÂY
PHÂN Tử)
Gel thường dùng là sephadex, sepharose. Ký hiệu
G-10, G-15, G-25 hay sepharose 4B, 6B. Chỉ số
càng nhỏ thì kích thước mắt lưới (lỗ) gel càng nhỏ.
Các phân tử mẫu khi đi qua hệ thống các hạt gel,
nếu có kích thước nhỏ hơn lỗ gel có thể chui vào
trong các hạt gel, do đó thời gian đi qua cột gel sẽ
lâu hơn các phân tử có kích thước lớn hơn =>
Phân chia các đại phân tử khác nhau về khối
lượng hay kích thước.
Áp dụng tinh sạch ban đầu, và thể tích mẫu nhỏ.
168
169
SắC KÝ ÁI LựC
Nguyên tắc dựa trên sự tương tác đặc hiệu sinh
học. E tương tác đặc hiệu với cơ chất (hoặc tương
đồng với cơ chất), cofactor, chất ức chế cạnh tranh.
Gắn với gel một chất có ái lực đặc hiệu với E
E được rửa (eluded) ra khỏi gel nhờ thay đổi nồng
độ muối hay pH của môi trường
170
3.4 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐỘ SẠCH CỦA
CHẾ PHẨM ENZYME
Điện di gel polyacrylamide (PAGE), đệm có chứa
sodium dodecyl sulfate (SDS), protein sẽ duỗi
thẳng tích điện âm di chuyển về phía cực dương
trong điện trường
Kết hợp điện di với sắc ký lọc gel
Phân tích khối phổ: protein được cắt bằng
protease đặc hiệu thành mảnh peptide nhỏ ->
phân tích khối phổ ->phổ các đỉnh peptide được
xác định , so sánh ngân hàng phổ peptide mà x.đ
được enzyme
Phương pháp x.định hoạt độ riêng.
171
Gel
electrophoresis
Bands
