2 Những bước cơ bản trong sơ đồ sản xuất enzyme từ vi sinh vật

4.2.1 TUYỂN CHỌN, CẢI TẠO VÀ BẢO



QUẢN GIỐNG VSV





Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có

hoạt lực cao: Yêu cầu đối với giai đoạn này là tuyển

chọn được chủng tổng hợp enzyme cần thiết, với lượng

đáng kể và hoạt tính cao. Môi trường tuyển chọn phân

lập thường từ đất, nước, lương thực, thực phẩm…. Tuy

nhiên các chủng phân lập theo phương pháp thông

thường, chỉ tổng hợp một lượng nhỏ enzym (enzyme bản

thể), người ta cần tiến hành gây đột biến bằng phương

pháp sinh học, lý, hóa học…để tạo chủng có khả năng

“siêu tổng hợp enzym” như: Phương pháp gây đột

biến; Phương pháp biến nạp; Phương pháp tiếp hợp

gene; Phương pháp tải nạp.



204



- Phương pháp gây đột biến:

Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để:

 Tạo những đột

biến bị

giảm khả

năng

sinh tổng hợp repressor

hoặc tổng hợp

repressor có ái lực thấp với gene operator.

 Tạo những đột biến tổng hợp enzim có cấu trúc bậc 1

thay đổi do đó có thể giảm độ thay đổi với kiểu kìm hãm

theo cơ chế liên hệ ngựơc.

 Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm

hoạt động hoặc ở gần đó thì có thể làm thay đổi rõ rệt

hoạt tính của enzim.

205



Gây đột biến ở đoạn gene hoạt hoá promotor để làm tăng

áp lực của nó đối với ARN- polymeraza do đó làm tăng

tốc độ sao chép mã.. Dùng biện pháp này có thể làm tăng

lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần.

 Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một

gene, chẳng hạn bị “lồi” một bazơ khi tái tạo phân tử

ADN. Ví dụ ở một vị trí nào đó trên gene có thứ tự

nucleotit là G-X, nếu nó bị thay thế bằng A-T, T-A hoặc

X-G thì phân tử mARN được tổng hợp trên đoạn gene bị

lồi này cũng sẽ khác với mARN bình thường ở vị trí

tương ứng với chỗ “lồi” trên gene. Do đó sẽ tổng hợp

nên phân tử enzim khác với bình thường ở một số gốc

axít amin.

 Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia

tử ngoại, tia phóng xạ) hay hoá học (các hoá chất) tác

dụng lên tế bào sinh vật.





206



- Phương pháp biến nạp:

 Là



sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi vi



sinh vật dưới ảnh hưởng của ADN trong dịch chiết

nhận được từ tế bào của vi sinh vật khác. Ở đây yếu

tố biến nạp là ADN. Sự chuyển vật liệu di truyền

(ADN) từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể xảy ra

trong ống nghiệm (invitro) khi tế bào nhận tiếp xúc

với dịch chiết từ tế bào cho mà không có sự tiếp xúc

giữa các tế bào.



207



tế bào có thể nhân bất kỳ loại ADN nào chứ

không đòi hỏi phải là ADN từ các giống họ hàng.

Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhân một số đoạn ADN

nhất định, thường không quá 10 đoạn. Các đoạn

ADN được di truyền trong biến nạp có M=106-107

và phải có cấu trúc xoắn kép. Tế bào không tiếp

nhận các đoạn ADN có kích thước nhỏ hơn hoặc các

đoạn không có cấu trúc xoắn kép. Hiện tượng biến

nạp phổ biến ở nhiều loài vi sinh vật như:

Diplococus,

Staphylococus,

Hemophilus,

Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Xantomonas.



 Các



208



- Phương pháp tiếp hợp gene:



với biến nạp, ở đây vật liệu

di

truyền

chỉ được truyền từ tế bào cho đến

tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau.

 Do vây các vi sinh vật có khả năng biến nạp thì

sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene

nữa. Hiện nay quá trình tiếp hợp gene đã được

nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E. coli,

salmonella, Pseudomonas aeruginosa.

 Khác



209



- Phương pháp tải nạp :

 Vật



liệu di truyền (ADN) được chuyển từ tế bào cho



sang tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực

khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn

ADN được chuyễn từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp

với ADN của tế bào nhận. Do đó làm biến đổi tính

chất di truyền của tế bào nhận.

210







Bảo quản giống vi sinh vật: Bên cạnh việc chọn

giống thuần chủng, đã được kiểm tra đầy đủ về các đặc

tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy, thì cũng cần lưu ý đến

điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống

gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu

nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền

và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu: Phương pháp cấy

chuyền; Phương pháp làm khô; Phương pháp đông khô;

Phương pháp bảo quản lạnh sâu.

211



-



-



Phương pháp cấy chuyền:



Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng

cách giữ giống trên môi trường thạch (thạch nghiêng,

hộp petri,...) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều

kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi

giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-40C và

sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại.

Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không

nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để bảo đảm không

chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới

(có thể gây nên những biến đổi bất lợi không thể lường

hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống

trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất đã khử trùng.

212



 Để



kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng

tháng đến 1 năm, người ta phủ một lớp paraphin

lỏng đã tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế

sự phát triển của nó. Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu

sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý.

 Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảo

quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu

hiệu, dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn,

hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư hỏng

giống gốc.

213







Phương pháp làm khô :



Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều

kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận). Trong

điều kiện như vây sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của

giống khi bảo quản. Phương pháp này rất hay được sử

dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loài nấm

men, vi khuẩn thời gian giữ giống có thể được 1 năm.







Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không

cần dụng cụ đắt tiền. Tuy nhiên giống như phương pháp

cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn.



214