PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tìm hiểu bệnh ký sinh trùng và thử nghiệm trị

bệnh sán dây trên cá giò nuôi lồng tại công ty

TNHH Ngọc Trại Nha Trang



ĐK và

KT

nuôi

lồng



Bệnh

và

biện

pháp

phòng

trị



Bố trí thí

nghiệm trị bệnh



Thu mẫu nghiên

cứu KST



Tìm hiểu kỹ thuật

nuôi và biện pháp

phòng trị bệnh



Xác

định

thành

phần

loài

KST



Xác

định

cường

độ, tỷ

lệ cảm

nhiễm



Làm

tiêu

bản ký

sinh

trùng



Dùng

hóa

chất

cho cá

ăn



Kết luận và đề xuất ý kiến

Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung và phương pháp nghiên cứu



27



2.1. Phương pháp tìm hiểu kỹ thuật nuôi và biện pháp phòng trị bệnh

Chủ yếu dựa trên các số liệu điều tra sơ cấp, trực tiếp phỏng vấn người nuôi cá

tại công ty:

Với nội dung tìm hiểu kỹ thuật nuôi bao gồm: điều kiện nuôi; kỹ thuật chuẩn bị

lồng, lưới; thả cá; chăm sóc quản lý: cho ăn, phân cỡ cá, thay lưới lồng, vệ sinh và

theo dõi các hoạt động của cá.

Phần tìm hiểu các biện pháp phòng trị bệnh với các nội dung: các loại bệnh

thường gặp, dấu hiệu bệnh lý, tác hại của bệnh, giai đoạn phát triển của bệnh, mùa vụ

của bệnh, và các biện pháp phòng trị bệnh.

Ngoài ra còn trực tiếp quan sát và thu thập số liệu thông qua các hoạt đông nuôi

cá trong thời gian thực tập tai công ty.

2.2. Phương pháp nghiên cứu bệnh ký sinh trùng

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng ở cá của viện sỹ

Dogiel (1929), của Hà Ký (1992), Bùi Quang Tề (2002) và Đỗ Thị Hòa (2004).



28



Sơ đồ nghiên cứu KST:

Nghiên cứu thành phần và mức độ cảm nhiễm KST trên cá giò



Thu mẫu ngẫu nhiên cá giò



Đo kích thước và cân khối lượng mẫu



Thu mẫu ký sinh trùng



Kí sinh trùng nội ký sinh



Kí sinh trùng ngoại ký sinh



Nhuộm, cố định và làm tiêu bản



Phân loại và mô tả KST



Xác định MĐCN các loài KST



Kết luận và đề xuất ý kiến

Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu thành phần và mức độ cảm nhiễm KST trên cá giò

2.2.1. Thu mẫu cá

Cá được thu ngẫu nhiên và trực tiếp từ lồng nuôi và vận chuyển bằng xô nhựa có

sục khí về phòng thí nghiệm của công ty và tiến hành kiểm tra trong ngày.



29



2.2.2. Thu mẫu KST

Phương pháp giải phẫu và kiểm tra:

Theo viện sỹ V. A. Dogiel có 2 phương pháp kiểm tra KST trên cá: Kiểm tra toàn

diện: giải phẫu và kiểm tra toàn bộ các cơ quan bên ngoài và bên trong của cá. Kiểm

tra từng phần: chỉ giải phẫu và kiểm tra một số cơ quan tập trung nhiều KST như

mang, ruột, xoang cơ thể. Số kiểm tra toàn diện ít nhất phải bằng 1/3 tổng số cá kiểm

tra. Ở đây chúng tôi áp dụng phương pháp kiểm tra từng phần.

Khi kiểm tra KST phải tuân thủ các qui tắc sau:

- Cá đưa vào kiểm tra phải còn sống hoặc vừa mới chết (không ươn thối).

- Kiểm tra bằng mắt thường trước, dụng cụ quang học sau.

- Kiểm tra các cơ quan bên ngoài trước, các cơ quan bên trong sau.

- Khi kiểm tra từng cơ quan, dụng cụ phải được lau chùi sạch sẽ để tránh nhầm

lẫn KST của cơ quan này với cơ quan khác.

- Khi quan sát thấy KST cần tiến hành kiểm đếm, đo để các định thành phần

giống loài, tỷ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm.

- Phải quan sát hình dạng và vẽ toàn bộ hình dạng cấu tạo của trùng rồi tiến hành

cố định để tiếp tục nghiên cứu sau.

Kiểm tra cơ quan ngoài

- Kiểm tra da :

Bắt cá đặt lên khay men, quan sát bằng mắt thường có thể thấy các hiện tượng

bệnh lý như da nhợt nhạt, cụt vẩy, trên da có những điểm tụ máu, tiết nhiều dịch

nhờn,… ngoài ra có thể phát hiện KST kích thước lớn như : Monogenea, Arlgulus;

Caligus; Piscicola ; Lerneea ; Nematoda.

Sau đó cạo sạch nhớt da, nên cạo đặc trưng trên toàn cơ thể, chú ý mơi tập trung

nhiều KST như gốc vẩy, bụng cá,…lấy nhớt cho lên 2 - 4 lamel, nhỏ thêm một giọt

nước muối sinh lý, đậy lamel rồi quan sát dưới kính hiển vi (theo thứ tự các vật kính:

4x; 10x; 40x). Dưới kính hiển vi, trong nhớt cá có thể gặp KST có kích thước nhỏ như:

Brooklynella sp; Ichthyophthyrius; Dactylogylus; Gyrodactylus; Sinergasilus;

Ergasilus…

Sau khi kiểm tra xong, cần tiến hành cân, đo kích thước cá



30



- Kiểm tra mang cá :

Cắt bỏ xương nắp mang rồi quan sát bằng mắt về màu sắc mang : đỏ tươi, đỏ sẫm

hay nhợt nhạt, dịch nhờn tiết ra nhiều hay ít, tơ mang có bị rách hay không, ngoài ra có

thể gặp một số KST có kích thước lớn thuộc Crustacea, bào mang Myxobolus…

Sau khi quan sát bằng mắt thường, cắt từng cung mang, lấy nhớt mang cho lên 2- 4

lamel, nhỏ nước muối sinh lý, đậy lamel rồi tiến hành quan sát dưới kính hiển vi (theo

thứ tự : 4x, 10x, 40x). Có thể gặp nhiều KST thuộc Protozoa, Monogenea.

Nếu phát hiện thấy nhiều sán lá đơn chủ cần định lượng trên toàn bộ mang. Nếu

chưa có thời gian định lượng thì cần cắt cung mang ngâm trong formalin 4%, trước khi

định lượng cần ngâm cung mang trong nước khoảng 24h để trùng no nước.

Kiểm tra các cơ quan bên trong :

Sau khi kiểm tra da và mang, ta bắt đầu kiểm giải phẫu cá để kiểm tra các cơ

quan bên trong của cá.

Dùng kéo cắt một đường cong từ hậu môn lên trước, cắt bỏ một bên vách bụng.

Sau đó dùng kéo cắt ruột sau ở sát hậu môn và ruột trước sát hầu lấy toàn bộ nội

tạng ra ngoài. Quan sát xoang cơ thể có thể gặp một số loài giun thuộc lớp : Nematoda,

Digenea, Acanthocephala,… Dùng panh tách riêng từng bộ phận: gan, tim, ruột, da

dày, bóng hơi,… rồi kiểm tra từng cơ quan.

- Tim: ngâm trong nước muối sinh lý quan sát bằng mắt thường, sau đó giải phẫu

tim để quan sát máu và cơ tim. Có thể gặp: Sanguinicola, Myxobolus…

- Gan: quan sát màu sắc, hình dạng của gan. Cắt một ít lá gan ép lên 2 tấm kính

lớn rồi dàn mỏng, quan sát bằng kính lúp hoặc bằng kính giải phẫu có thể gặp bào

nang của Digenea và Myxobolus. Đồng thời kiểm tra dịch mật và túi mật.

- Ruột: dùng kéo nhỏ giải phẫu ruột. Quan sát bằng mắt thường hoặc bằng kính

lúp có thể gặp Acanthocephala, Digenea, bào nang của bào tử trùng Sporozoa và thích

bào tử trùng Cnidosporidia. Sau đó lấy nhớt (cách làm như nhớt mang) quan sát có thể

gặp giun sán kích thước nhỏ.

- Dạ dày: tương tự như ruột.

- Mắt: dùng kéo nhọn cắt mắt ra ngoài, quan sát dưới dụng cụ quang học có thể

gặp ấu trùng sán lá Diplostomulum giai đoạn Metacercaria.



31



2.2.3. Phương pháp thu thập, cố định và bảo quản trùng.

Khi kiểm tra cần phải ghi chép, nhận xét và vẽ sơ bộ cấu tạo hình dạng của KST.

Vẽ sơ bộ trùng có ý nghĩa hết sức quan trọng, làm cơ sở cho phân loại sau này.

Các loại KST khác nhau có phương pháp thu thập, cố định trùng khác nhau.

KST thuộc Protozoa:

Thu mẫu bằng phương pháp phết kính. Dùng 2 lamel, một lamel có nhớt chứa

trùng và 1 lamel sạch kéo nhẹ 2 lần lên nhau làm cho lớp nhớt trên lamel thật mỏng.

Thả các lamel vào dung dịch shandine, úp mặt có trùng xuống nước, sau đó lật lại và

dìm toàn bộ vào dung dịch. Sau 10 – 15 phút, rửa lại các lamel qua nước cất rồi cho

vào cồn 70o trong thời gian 5 – 10 phút, sau đó nhúng vào dung dịch cồn iốt 10 – 15

phút (có thể khử được HgCl2 có trong shandine). Cuối cùng bảo quản trong cồn 700.

Riêng KST thuộc các giống Trichodina; Brooklynella ngoài cách thu mẫu như

trên (để sau này nhuộm bằng hematoxylin) thì còn có thể thu thập và cố định bằng

cách đơn giản hơn (để sau này nhuộn bằng nitrat bạc) như sau : lấy nhớt da, mang có

nhiều trùng phết lên lamel sạch, phết xong để làm khô tự nhiên, tránh ruồi muỗi đậu

vào. Sau khi làm khô, dùng giấy quấn lamel lại cho gọn có thể bảo quản được trong

vòng 15 – 20 ngày.

Những giống loài thuộc lớp bào tử trùng (Sporozoa) và thích bào tử trùng

(Cnidosporidia) có phương pháp thu mẫu khác: khi phát hiện thấy bào tử nang cần tiến

hành làm tiêu bản ngay không cần nhuộm. Nghĩa là để bào nang của trùng lên lamel.

Nhỏ giọt bom canada, đậy lamel lại và dán etyket.

KST thuộc Monogenea:

Một số giống loài sán lá đơn chủ Dactylogyrus, Gyrodactylus kích thước nhỏ,

không nhìn thấy bằng mắt thường. Để thu mẫu ta dùng dùi nhỏ tách riêng từng con

trùng ra khỏi tơ mang dưới kính giải phẫu. Dùng micropipet hút trùng ra và tiến hành

làm tiêu bản ngay.

Riêng các giống Diplozoon sán lá đơn chủ có kích thước lớn ta cần tiến hành thu

mẫu như sán lá song chủ.

KST thuộc Digenea:

Dùng panh hoặc dùi nhỏ tách trùng ra khỏi tổ chức cơ thể, cho vào hộp lồng chứa

nước muối sinh lý rửa cho thật sạch. Đặt trùng lên lamel, tiến hành ép trùng bằng cách



32



dùng vasenlline chấm lên 4 góc vừa với kích thước lamel, sau đó đậy lamel lại và ép từ

từ đến khi trùng mỏng dần và có thể nhìn thấy nội tạng bên trong là được.

Có thể dùng boin; axit axêtic; cồn 700 nhỏ vào lamel chứa trùng vừa ép để cố

định trùng (tuỳ thuộc vào thời gian trùng lớn hay nhỏ mà thời gian cố địng dài hay

ngắn). Khi cố định bằng boin thì trùng chắc chắn nhưng bị dòn, dễ gãy vỡ. Khi cố định

bằng cồn thì trùng không dòn nhưng để lâu thì hút nước, gây khó khăn cho việc nhuộm

màu tiêu bản sau này.

Cố định xong lấy trùng ra khỏi 2 tấm ép và bảo quản trùng trong cồn 70o.

KST thuộc Cestoidea:

Dùng dùi gỡ trùng cho vào nước muối sinh lý để rửa trùng, sau đó đặt lên lamel

và ép. Cố định giống như sán lá song chủ.

Trùng cũng được bảo quản trong cồn 70o.

KST thuộc Nematoda:

Với giun tròn kích thước lớn, dùng panh thu trùng bằng mắt thường. Nếu giun

tròn kích thước nhỏ thì hòa tan dịch da, mang, ruột vào nước muối sinh lý, dùng

micropipet hút trùng ra.

Cố định trùng trong cồn 70o đun nóng (mục đích làm cho trùng duỗi thẳng,

không co quắp). Bảo quản trùng trong cồn 70o.

2.2.4. Phương pháp làm tiêu bản ký sinh trùng.

Mỗi loài KST khác nhau tiến hành làm tiêu bản khác nhau. Đây là thao tác cuối

cùng nhưng rất quan trọng.

Nguyên sinh động vật – Protozoa:

Trước khi tiến hành làm tiêu bản cần tiến hành nhuộm trùng. Đối với Protozoa

khác nhau có thể tiến hành nhuộm bằng hai cách sau:

Nhuộn bằng hematoxylin: có thể dùng để nhuộm cho tất cả các loại Protozoa

khác nhau, trừ các giống loài Cnidosporidia và Sporozoa.

Làm cho trùng no nước: ngâm trùng trong các thang cồn có nồng độ nhỏ dần:

70o, 50o , 30o,10o. Mỗi thang cồn để khoảng 10 – 20 phút.

Cho mẫu vật vào dung dịch cồn axit hoặc dung dịch Feric Sulffattamonni 2 4%, thời gian ngâm phụ thuộc vào từng KST: bộ tiêm mao trùng (Ciliata) ngâm 2 –

4h; bộ tiên mao trùng (Flagellata) ngâm 6 -10h.



33



Sau đó dùng nước cất rửa hai lần, mỗi lần 5 phút.

Ngâm trong dung dịch hematoxylin khoảng 2 – 10 phút để trùng bắt màu.

Rửa qua nước 30 – 60 phút.

Nếu quá đậm màu có thể làm nhạt màu bằng cá rửa trùng qua dung dịch cồn axit

hoặc Feric Sullfattamoni khoảng 6 – 8h. Khi thấy Protozoa bắt màu xanh tro hoặc màu

tím thì lấy trùng ra.

Rửa qua nước chảy nhẹ 1 – 2h.

Làm mất nước: bằng cách cho trùng qua các thang cồn có nồng độ cao dần: 10o,

30o, 50o, 70o, 90o, 100o, cồn xylen (tỷ lệ 1/1), rửa qua xylen để làm trong trùng.

Gắn tiêu bản bằng bom canada.

Nhuộm bằng nitrat bạc (AgNO3) 2%: dùng thuốc nhuộm này để nhuộm trùng

thuộc các giống Trichodina; Brooklynella. Ưu điểm của phương pháp này là các vòng

răng của trùng được thấy rõ, thuận lợi cho phân loại.

Xếp lamel có trùng vào khay hoặc chậu thuỷ tinh (để mặt có trùng lên trên), nhỏ

nitrat bạc 2% vào đều khắp mặt lamel.

Để chậu thuỷ tinh trong bóng tối 10 phút.

Lấy mẫu ra rửa trong nước sạch nhiều lần, dựng nghiên cho khô.

Gắn tiêu bản bằng bom canada, có thể dùng glyxerin – gelatin để gắn tiêu bản

nhưng với khí hậu nóng ẩm của Việt Nam rất dễ bị mốc và hỏng tiêu bản.

Sán lá đơn chủ Monogenea.

Với sán lá đơn chủ kích thước nhỏ (Dactylogyus, Pseudorhabdosynochus,

Ancyrocephalus) cách làm tiêu bản rất đơn giản, sán sau khi bắt ra rửa qua nước muối

sinh lý, cố định bằng cồn 70o, sau đó để khô cồn và dán bom canada.

Với sán lá đơn chủ kích thước lớn (Diplozoon, Benedenia, Neobenedenia) làm

tiêu bản tương tự như sán lá song chủ.

Sán lá song chủ (Digenea) và sán lá dây (Cestoidea):

Lấy trùng ra khỏi dung dịch bảo quản.

Làm trùng no nước qua các thang cồn nồng độ nhỏ dần: 70o, 50o, 30o, 10o, 0o, ở

mỗi nồng độ cồn nên để khoảng 15 – 20 phút.



34



Cho trùng vào dung dịch carmine hoặc hematoxylin trong thời gian từ 1 – 3h.

Quan sát dưới kính hiển vi thấy tầng trung bì cơ thể trùng màu đỏ, các cơ quan bên

trong có màu đỏ đậm, nhạt không giống nhau (nên nhuộm bằng hematoxylin),

Nếu bắt trùng màu quá đậm nên làm nhạt màu bằng cách nhúng trùng vào cồn

axit chlorhydric.

Nhúng trùng và rửa qua nước chảy nhẹ 1h.

Làm mất nước trùng qua các thang cồn nồng độ cao dần: 10o, 30o, 50o, 70o, 90o,

100o, cồn xylen và cuối cùng là xylen (mỗi thang khoảng 15 phút).

Gắp trùng ra để khô và gắn tiêu bản bằng bom canada.

Dán etyket, ghi rõ tên trùng, ký chủ, cơ quan ký sinh.

Giun tròn (Nematoda) và giáp xác (Crustacea)

Lớp Nematoda (hoặc Crustacea) không cần nhuộm và làm tiêu bản, trước khi

quan sát cần ngâm trùng trong dung dịch làm trong axit lactic hoặc cồn glyxerin. Thời

gian ngâm khoảng 20 phút đến 1 ngày tuỳ theo kích thước trùng, ngâm đến khi trùng

trong suốt.

Sau khi quan sát xong trả trùng về dung dịch cố định (cồn 70o).



35



2.3. Thí nghiệm trị bệnh Cestoidea

Sơ đồ phương pháp trị bệnh sán dây:

Cá giò bị bệnh do sán dây ký sinh



Kiểm tra để xác định TLCN và CĐCN



Đối chứng 1



Customix



5.0g/

kg



10.0g/

kg



Hadaclean A



2.5g/

kg



5.0g/

kg



Đối chứng 2



2.5g/

kg



5.0g/

kg



Đánh giá tác dụng của thuốc đối với KST.

Đánh giá sức khỏe của cá



Kết luận thí nghiệm



Hình 2.3: Thử nghiệm dùng thuốc với nồng độ khác nhau để trị bệnh sán dây



36



- Cá thí nghiệm (cỡ 15 - 30 cm, 70 -150g) được bắt từ 1 đàn cá trước đó phát

hiện có cảm nhiễm Cestoidea với cường độ cao, bị bệnh với các dấu hiệu như đã được

mô tả phần kết quả nghiên cứu. Kiểm tra thấy 100% cá bị nhiễm sán dây với cường độ

cao trung bình 253,5 trùng/lamel; lác đác có hiện tượng gầy yếu và chết (số cá kiểm

tra ít nhất là 10% số lượng cá thí nghiệm).

Thí nghiệm được thực hiện như sau: Dùng hai loại thuốc là các loại thuốc đặc trị

bệnh giun sán ký sinh trong ruột và dạ dày: Customix 3810 hàm lượng Praziquantel

50%; Hadaclean A với hàm lượng Praziquantel 5%, đây là hai sản phẩm của công ty

Bayer. Mỗi loại hóa chất ở 2 mức nồng độ khác nhau. Mục đích là tìm ra loại thuốc và

nồng độ thích hợp có thể tiêu diệt Cestoidea và ít ảnh hưởng đến sức khỏe của cá. Hai lô

đối chứng: một lô không sử dụng thuốc; lô còn lại sử dụng men vi sinh (Lipto Proc C,

Liptosa Lipidos Toledo S.A, sản phẩm của Tây Ban Nha) ở hai mức nồng độ khác nhau.

Thí nghiệm được tiến hành trong 7 giai (giai 8 m3), các giai được đặt trong lồng

lớn để hạn chế tác động của sóng, gió. Đàn cá trước khi thí nghiệm được kiểm tra mức

độ cảm nhiễm sán dây, số lượng mẫu là 30 con cá. Mỗi lô thí nghiệm bố trí 50 con cá.

Thuốc được hòa vào nước rồi trộn vào thức ăn tổng hợp dạng viên khô (đơn vị tính g

thuốc/kg thức ăn). Sau khi thuốc ngấm vào thức ăn, tiến hành thêm dầu mực để tăng

tính bền vững và hạn chế thất thoát thuốc vào trong nước. Ngoài ra việc trộn dầu mực

còn có tác dụng kích thích cá ăn mồi. Thao tác cho ăn được lặp lại 5 ngày liên tiếp, chế

độ cho ăn 1 lần/ngày (lúc 8h). Sau 5 ngày trị bệnh tiến hành mổ cá kiểm tra tỷ lệ cảm

nhiễm và cường độ cảm nhiễm sán dây sau thí nghiệm đồng thời theo dõi tình trạng

sức khỏe của cá thí nghiệm.

Các thí nghiệm không được lặp lại. Theo dõi các hoạt động của cá và một số yếu

tố môi trường trong quá trình thí nghiệm trị bệnh (nhiệt độ, độ mặn và pH).

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

2.4.1.



Phương pháp đo, đếm KST

Phương pháp đo KST:



Đối với KST có kích thước lớn (giun) thì đo chiều dài bằng thước kẹp, thước

nhựa. Đối với các KST có kích thước nhỏ hơn (sán, giáp xác) hay một số cơ quan bộ

phận của KST có thể đo bằng kích giải phẫu hay kính hiển vi có gắn thước đo.



37