0,5 - 10 µg/ml
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.62 MB, 101 trang )
Tài
liệu
[33]
[32]
Mẫu thử
Cây bách hoa xà
thiệt thảo
(Oldenlandia
diffusa)
Lá, rễ, thân các
loài Swertia
Pha động
Cột
Detector
- Cột: Zorbax Eclipse
XDB- C18 (250 × 4,6
- MeOH: H2O (83:17 chứa 0,2%
NH4OAc, pH 6,74)
mm, 5 μm)
- Tiền cột: C18 (7,5 ×
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
4,6 mm, 5 μm)
- Nhiệt độ phòng
- A : MeCN:H2O (20:80)
- B: 100% MeCN
- Chương trình gradient:
- Hypersil BDS C8
0 phút: 75% B
(200 mm × 4,6 mm,
15 phút: 85% B
5μm)
- Cân bằng cột trước khi tiêm mẫu - Nhiệt độ cột: 300C
tiếp theo với pha động ban đầu
trong 10 phút
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
17
UV
(210 nm)
FLD:
λex= 272 nm
λem=505 nm
Thể
tích
tiêm
mẫu
( µl )
20
Đường chuẩn
Độ đúng
Độ lặp lại
5,03-201,2 μg/ml
r2= 0,9998
99,8%
RSD = 3,44%
(n = 9)
RSD = 1,81%
(n=6)
32 – 640 ng/ml
r = 0,9999
98,23 - 101,35%
Tài
liệu
[31]
[23]
Mẫu thử
Pha động
Cột
Detector
Một số loài quả
(thịt quả, hạt, vỏ
hoặc toàn quả)
- Rửa giải gradient:
A: MeCN:H2O (30:70)
B: 100% MeCN
- Chương trình dung môi:
- Hypersil BDS C8
Phút 0: 60%B,
(200mm × 4,6 mm,
Phút 20: 80% B,
5 μm)
- Cân bằng cột trước khi tiêm mẫu - Nhiệt độ cột: 320C
tiếp theo với pha động ban đầu
trong 10 phút
- Tốc độ dòng:1 ml/phút
Một số dược liệu:
rễ, lá, hạt, quả…
MS
- Nguồn ion
hóa ESI –
- MeOH: dd acid formic 10mM - DL-C18 (250 × 4,6 - Chế độ
SIM: lựa
(83:17)
mm, 5,0 µm)
chọn mảnh
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
- Nhiệt độ cột: 30°C
có m/z =
455
[M - H]-
18
Thể
tích
tiêm
mẫu
( µl )
10
Độ đúng
0,05-6,5 μg/ml
r>0,9998
FLD:
λex= 404nm,
λem= 440nm
Đường chuẩn
94,7-103,4%
0,04-40 μg/ml
r2 = 0,9991
96,5-108,2%
Độ lặp lại
Tài
liệu
[37]
Mẫu thử
Một số loài
Origanum
Pha động
Cột
Detector
MS
- Nguồn ion
- Hệ thống 2 cột:
hóa ESI+
- A: Dd amoni format 5mM, pH
+ Synergi Polar – RP
7,4, chỉnh pH bằng NH4OH
- Chế độ
(50 × 4,6 mm; 4
- B: Dd amoni format 5 mM trong
SIM: lựa
µm)
90% MeOH, pH 7,4
chọn mảnh
+ Microsorb C18 (100
- Tỷ lệ: 13,5% A và 86,5% B
có m/z =
× 4,6 mm; 3 µm)
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
479
- Nhiệt độ cột: 250C
[M + Na]+
19
Thể
tích
tiêm
mẫu
( µl )
10
Đường chuẩn
Độ đúng
r2 > 0,999
94,1 -100,8%
Trung bình:
97,4%
RSD = 3,4%
Độ lặp lại
- Trong ngày:
RSD=5,37%
(n=6)
- Khác ngày
(3 ngày)
RSD=6,41%
1.4 PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH
PHÂN TÍCH HPLC
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC
HPLC là một kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất
trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp
suất cao [3].
Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2
pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động.
Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó [2].
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector. Nếu ghi quá
trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều
pic. Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy
nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc đồ.
1.4.2. Thẩm định quy trình phân tích HPLC
1.4.4.1. Yêu cầu chung
Các quy trình phân tích bằng HPLC cần phải thẩm định là các quy trình
chưa được công bố trong bộ tiêu chuẩn Dược điển các nước.
Nội dung về thẩm định phương pháp được hướng dẫn trong các tài liệu về
phân tích và được quy định trong các Dược điển [6], [22], [24], [30], [42].
Thông số đặc trưng của kỹ thuật HPLC cần đánh giá khi thẩm định
phương pháp định lượng dược chất chính, đa lượng bao gồm: tính đặc hiệu/
chọn lọc, tính tuyến tính – khoảng xác định, độ đúng, độ chính xác.
1.4.4.2. Nội dung thẩm định phương pháp
a. Tính chọn lọc
20
Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi
có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Phương
pháp HPLC được coi là có tính chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu:
1) Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý
nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn.
2) Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong
khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.
b. Tính tuyến tính và khoảng nồng độ
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hay
chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử. Khoảng tuyến tính là
khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng
tuyến tính.
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b
với hệ số tương quan tuyến tính r.
Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Đường chuẩn phải có ít nhất 5 mức nồng độ;
- Nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn phải bao phủ khoảng
xác định của phương pháp;
- Các mẫu chuẩn có thể được chuẩn bị bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn
ban đầu hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau;
- Một quy trình HPLC thông thường dùng định lượng phải có hệ số tương
quan tuyến tính của đường chuẩn r ≥ 0,999.
c. Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy
trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng
21
