Xây dựng quy trình xử lý mẫu và lựa chọn điều kiện sắc ký
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.62 MB, 101 trang )
saponin để tách sapogenin và đường thường được tiến hành. Quá trình thủy phân
saponin thường được thực hiện bằng các phương pháp sau:
Nếu phần aglycon (sapogenin) bền vững với các tác nhân thủy phân thì
có thể dùng acid mạnh, ví dụ HCl 5%, có trường hợp dùng đến 18%,
hoặc H2SO4 10% trong cồn;
Một số tác giả dùng acid perchloric để thủy phân saponin;
Trường hợp phần aglycon (sapogenin) rất dễ bị biến đổi trong quá trình
thủy phân, cần phải chọn điều kiện nhẹ nhàng, ví dụ thủy phân bằng
acid acetic 50% ở nhiệt độ 700C trong 6 giờ.
Tham khảo một số tài liệu về chiết xuất acid oleanolic trong dược liệu [4],
[16], [17], [18], [37], đồng thời so sánh với các quy trình chung về chiết xuất
sapogenin như trên, chúng tôi tiến hành khảo sát một số quy trình xử lý mẫu bao
gồm quy trình chiết lỏng – rắn có gia nhiệt và chiết siêu âm để tìm ra phương
pháp chiết xuất phù hợp nhất với đối tượng nghiên cứu là dược liệu đinh lăng và
cao khô đinh lăng.
2.3.1.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký
Dùng phương pháp HPLC pha đảo để tách, định tính, định lượng
acid oleanolic trong đinh lăng. Cụ thể, chúng tôi khảo sát các điều kiện như sau.
- Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo của các hãng khác
nhau;
- Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành
phần, tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau;
- Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV,
FLD, MS để đảm bảo vừa phát hiện được được chất phân tích, vừa tiện lợi
cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm;
26
- Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất.
2.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích
2.3.2.1. Tính chọn lọc
Chuẩn bị các mẫu sau:
1. Mẫu trắng
2. Mẫu acid oleanolic chuẩn pha trong MeOH
3. Mẫu thử
So sánh các pic trên các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.
2.3.2.2. Tính tuyến tính và khoảng nồng độ
Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn acid oleanolic pha trong MeOH có nồng độ
như sau: 5 - 10 - 20 - 25 - 35 μg/ml.
Tiến hành phân tích các mẫu. Xây dựng phương trình hồi quy và xác định
hệ số tương quan r.
2.3.2.3. Độ lặp lại
Tiến hành phân tích 1 mẫu thử 5 lần song song (xử lý mẫu, sắc ký), xác
định kết quả định lượng theo đường chuẩn pha trong MeOH, tiến hành trong
cùng điều kiện. Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa
giá trị của các lần định lượng.
2.3.2.4. Độ đúng
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử sao cho
nồng độ acid oleanolic vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
Tiến hành:
Chuẩn bị các dung dịch sau:
- Dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp
- Dung dịch thử
27
- Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử (dược liệu và cao)
một lượng chính xác chất chuẩn bằng khoảng 40% lượng
acid oleanolic có trong mẫu thử, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký
theo quy trình đã xây dựng
Từ kết quả chạy sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn sẽ tính
được phần trăm tìm lại so với lượng chuẩn thêm vào mẫu thử.
2.3.2.5. Độ ổn định của acid oleanolic trong thời gian phân tích
Để đánh giá độ ổn định của acid oleanolic trong quá trình định lượng, chúng
tôi tiến hành khảo sát độ ổn định của dung dịch chuẩn acid oleanolic trong điều
kiện sắc ký đã lựa chọn.
Xác định độ ổn định bằng cách pha một dung dịch chuẩn có nồng độ nằm
trong khoảng tuyến tính. Cứ sau 4 giờ thì tiêm lặp lại dung dịch một lần, tiến
hành phân tích trong 24 giờ. Xác định sự thay đổi nồng độ acid oleanolic theo
thời gian.
2.3.3. Ứng dụng
Áp dụng phương pháp đã xây dựng và thẩm định, tiến hành định tính, định
lượng acid oleanolic trong một số mẫu dược liệu và cao khô đinh lăng, bao gồm:
các mẫu dược liệu thu hái ở Hòa Bình (4 mẫu), Nam Định (12 mẫu), Đắcknông
(3 mẫu) và các mẫu cao khô đinh lăng thu hái ở Hòa Bình (1 mẫu), Nam Định
(5 mẫu) do Công ty Traphaco cung cấp.
2.3.4. Xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 và phần mềm Microsoft
Office Word 2007 để xử lý số liệu và trình bày kết quả.
28
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN
ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
3.1.1. Lựa chọn dược liệu
Dược liệu đinh lăng do Công ty Traphaco cung cấp cho nghiên cứu, được
thu mua ở các vùng trồng dược liệu khác nhau như Hòa Bình, Nam Định,
Đắcknông.
Trước tiên, dược liệu được xác định đúng tên khoa học là
Polyscias fruticosa, họ Nhân sâm Araliaceae.
Bào chế cao khô đinh lăng từ dược liệu đinh lăng bằng công nghệ sấy phun.
Đối tượng nghiên cứu của đề tài bao gồm dược liệu đinh lăng và cao khô
đinh lăng.
3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu
Qua tham khảo một số tài liệu [4], [16], [17], [18], [37] chúng tôi tiến hành
khảo sát một số quy trình xử lý mẫu như sau.
3.1.2.1. Quy trình 1
- 2,5 gam bột dược liệu hoặc 1,25 gam cao dược liệu chiết hồi lưu với 30 ml
tetrahydrofuran (THF) để loại chất béo;
- Chiết hồi lưu với 50 ml EtOH 80%, đây là loại dung môi vạn năng có khả
năng hòa tan không chọn lọc, có thể chiết xuất hầu hết các hoạt chất có
trong dược liệu;
- Bay hơi ethanol;
- Dịch chiết đậm đặc (khoảng 5 ml) thu được pha loãng gấp đôi với nước cất;
29
