Tính tuyến tính và khoảng nồng độ
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.62 MB, 101 trang )
Hình 3.16 – Sắc ký đồ các mẫu acid oleanolic chuẩn nồng độ 5 - 35 µg/ml
Bảng 3.7 – Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic
Nồng độ acid oleanolic (μg/ml)
5
10
20
25
35
Diện tích pic (mAU.s)
26,2
53,1
111,1
140,3
188,3
Diện tích pic (mAU.s)
Phương trình hồi quy: S = 5,475 C – 0,233 (S: diện tích pic, C: nồng độ acid oleanolic )
Hệ số tương quan hồi quy: r = 0,9991
250
S = 5,475 C - 0,233
r = 0,9991
200
150
100
50
0
0
10
20
30
40
Nồng độ acid oleanolic (μg/ml)
Hình 3.17 – Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic
và nồng độ acid oleanolic
52
Kết quả ở bảng 3.7 và hình 3.17 cho thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát
5- 35 μg/ml có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ
acid oleanolic với hệ số tương quan tuyến tính r xấp xỉ bằng 1 (0,9991).
3.2.5. Độ lặp lại
Tiến hành xử lý mẫu như sơ đồ hình 3.7 mục 3.1.4, 5 lần song song trên
mẫu thử (mẫu dược liệu đinh lăng số 14, mẫu cao đinh lăng số 1) và chạy sắc ký
với điều kiện như ở mục 3.1.4. Xây dựng đường chuẩn và tính nồng độ
acid oleanolic trong các mẫu theo đường chuẩn. Xác định độ lặp lại bằng cách
tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng.
Kết quả xác định độ lặp lại được trình bày trong bảng 3.8 và bảng 3.9.
Bảng 3.8 – Kết quả xác định độ lặp lại tiến hành trên mẫu bột dược liệu
Lần
Khối lượng
cân (g)
Độ ẩm (%)
Diện tích pic
(mAU.s)
Hàm lượng
(mg/g)
1
2,5501
4,78
109,1
0,1038
2
2,5623
4,78
110,1
0,1042
3
2,4989
4,78
99,5
0,0969
4
2,5112
4,78
111,9
0,1080
5
2,5423
4,78
104,7
0,1000
RSD (%)
4,14
Bảng 3.9 – Kết quả xác định độ lặp lại tiến hành trên mẫu cao khô dược liệu
Lần
Khối lượng
cân (g)
Độ ẩm (%)
Diện tích pic
(mAU.s)
Hàm lượng
(mg/g)
1
1,2701
7,77
82,3
0,1588
2
1,2693
7,77
80,5
0,1558
3
1,2500
7,77
77,6
0,1530
4
1,2688
7,77
75,6
0,1472
5
1,2605
7,77
84,6
0,1641
53
RSD (%)
4,06
Kết quả cho thấy phương pháp có độ lặp lại chấp nhận được, với giá trị
RSD(%) khi tiến hành phân tích một lô gồm 5 mẫu bột dược liệu hoặc cao khô
dược liệu đều nhỏ hơn 5%.
3.2.6. Độ đúng
Xác định độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn.
- Dung dịch thử: Tiến hành chuẩn bị như phần dung dịch thử
- Dung dịch thử thêm chuẩn: Thêm vào mẫu bột dược liệu 99,02 µg
acid oleanolic, mẫu cao dược liệu 74,23 µg acid oleanolic. Tiến hành
xử lý mẫu và chạy sắc ký như quy trình đã được trình bày ở mục 3.1.4
Lặp lại thực nghiệm 5 lần khác nhau. Dựa vào đường chuẩn xây dựng cùng
ngày phân tích, tính được lượng acid oleanolic trong các mẫu. Kết quả được
trình bày ở bảng 3.10 và bảng 3.11.
Bảng 3.10 – Kết quả xác định độ đúng tiến hành trên mẫu bột dược liệu
STT
Lượng cho thêm
(µg)
Lượng tìm lại
(µg)
Phần trăm tìm lại
(%)
1
99,02
95,50
96,4
2
99,02
103,50
104,5
3
99,02
100,02
101,0
4
99,02
100,26
101,3
5
99,02
98,99
100,0
Phần trăm tìm lại trung bình: 100,6%
Độ lệch chuẩn tương đối: 2,88%
54
Bảng 3.11 – Kết quả xác định độ đúng tiến hành trên mẫu
cao khô dược liệu
STT
Lượng cho thêm
(µg)
Lượng tìm lại
(µg)
Phần trăm tìm lại
(%)
1
74,23
73,42
98,9
2
74,23
77,65
104,6
3
74,23
74,00
99,7
4
74,23
76,65
103,3
5
74,23
75,34
101,5
Phần trăm tìm lại trung bình: 101,6%
Độ lệch chuẩn tương đối: 2,34%
Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng tốt:
- Độ đúng trung bình cao: 100,6% và 101,6%
- Độ đúng của mỗi lần đều nằm trong khoảng 96,4% – 104,6%.
3.2.7. Độ ổn định của dung dịch chuẩn acid oleanolic
Do thời gian phân tích mẫu trong một lần phân tích thường khá dài (khoảng
12- 18 giờ), mẫu chuẩn thường được phân tích ở cả đầu và cuối của quy trình
phân tích trong một ngày. Để đảm bảo giảm thiểu sai số trong quá trình định
lượng, chúng tôi tiến hành xác định độ ổn định của mẫu acid oleanolic chuẩn
trong vòng 24 giờ.
Chuẩn bị một dung dịch acid oleanolic chuẩn có nồng độ 20 µg/ml, tiến
hành sắc ký theo điều kiện nêu ở mục 3.1.4.
Cứ sau 4 giờ tiêm lặp lại một lần, trong vòng 24 giờ. Kết quả được trình bày
ở bảng 3.12.
55
Bảng 3.12 – Kết quả độ ổn định của mẫu acid oleanolic
STT
Thời gian (giờ)
Diện tích pic
(mAU.s)
Nồng độ
(µg/ml)
1
0
112
20,49
2
4
112,3
20,55
0,2679
3
8
111,5
20,40
0,4464
4
12
114,2
20,89
1,9643
5
16
113,4
20,75
1,2500
6
18
111,9
20,47
0,0893
7
20
112,5
20,58
0,4464
8
24
110,4
20,20
1,4286
P(%)
Trong đó:
- P(%): Phần trăm chênh lệch nồng độ acid oleanolic sau thời gian bảo quản
so với mẫu mới chuẩn bị.
Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ acid oleanolic trong mẫu bảo quản
thay đổi không đáng kể so với mẫu mới pha (P(%) < 2%). Như vậy
acid oleanolic ổn định trong thời gian phân tích.
Nhận xét chung:
Từ những kết quả thẩm định về tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính,
độ đúng, độ lặp lại, độ ổn định của dung dịch chuẩn, chúng tôi cho rằng
phương pháp HPLC định lượng acid oleanolic trong dược liệu đinh lăng và cao
khô đinh lăng thu được ở trên hoàn toàn phù hợp để ứng dụng đánh giá nồng độ
acid oleanolic trong đinh lăng của các mẫu thực (bao gồm các mẫu dược liệu
đinh lăng và các mẫu cao khô đinh lăng).
56
