Xây dựng quy trình xử lý mẫu

- Lắc với BuOH bão hòa nước (3 lần x 10 ml), để chiết chọn lọc lấy thành

phần saponin;

- Thu hồi dung môi BuOH;

- Dịch nước thu được để nguội, rót từ từ vào khoảng 30 thể tích ether, để lạnh

qua đêm, để thu lấy saponin kết tinh (do saponin không tan trong ether);

- Rửa tủa saponin thu được với ether;

- Hòa tan tủa saponin thu được trong 10 ml cồn 700;

- Thêm 30 ml dung dịch HCl 1N, đun sôi hồi lưu cách thủy 2h để thủy phân

saponin thành sapogenin;

- Lắc với CHCl3 (2 lần x 15 ml), để hòa tan sapogenin, cô trên cách thủy đến

cạn (mục đích giai đoạn này là để tinh chế sapogenin thu được);

- Hòa tan cắn trong 10 ml MeOH sắc ký, lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiêm sắc

ký.

3.1.2.2. Quy trình 2

- 2,5 gam bột dược liệu hoặc 1,25 gam cao dược liệu, chiết với MeOH, đây là

loại dung môi vạn năng có khả năng hòa tan không chọn lọc, có thể chiết

xuất hầu hết các hoạt chất có trong dược liệu;

- Thêm 20 ml dung dịch HCl đặc, đun sôi hồi lưu cách thủy 2h, với mục đích

thủy phân để cắt bỏ phần đường trong phân tử saponin;

- Để lạnh để tủa hết phần sapogenin;

- Hòa tan sapogenin trong cắn trong 25 ml CHCl3, cô trên cách thủy đến cạn

(mục đích giai đoạn này là để tinh chế sapogenin thu được);

- Hòa tan cắn (sapogenin) trong 10 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 µm

được dung dịch tiêm sắc ký.



30



3.1.2.3. Quy trình 3

- 2,5 gam bột dược liệu hoặc 1,25 gam cao dược liệu chiết siêu âm với

MeOH (3 lần x 20 ml);

- Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn;

- Hòa tan cắn trong 10 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 µm được dung dịch

tiêm sắc ký.

Lựa chọn quy trình mà khi phân tích bằng HPLC cho pic acid oleanolic tách

rời hoàn toàn khỏi các pic tạp trong mẫu và cho kết quả nồng độ acid oleanolic

(µg/ml) cao nhất với cùng một lượng mẫu thử. Kết quả nồng độ acid oleanolic

thu được từ 3 quy trình xử lý mẫu trên được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1 – Nồng độ acid oleanolic thu được từ

các quy trình xử lý mẫu khác nhau



17,15



2



18,00

8,98



1



23,11



2



23,40



3



1,25 gam cao khô dược

liệu



Nồng độ acid oleanolic thu

được (µg/ml)



3



2,5 gam bột dược liệu



Quy trình

1



Khối lượng dược liệu



10,47



Nhận xét:

Mẫu thử của cả 3 quy trình 1, 2, 3 khi đem phân tích bằng phương pháp

HPLC đều cho pic acid oleanlic tách rời hoàn toàn khỏi các pic tạp.

Quy trình 3 cho kết quả nồng độ acid oleanolic thấp hơn nhiều so với hai

quy trình 1 và 2. Nồng độ acid oleanolic thu được từ hai quy trình 1 và 2 tương

đương nhau. Tuy nhiên quy trình 1 sử dụng nhiều dung môi hữu cơ nên không



31



kinh tế, độc hại do đó chúng tôi lựa chọn quy trình 2 và tiếp tục khảo sát thay

đổi các điều kiện chiết xuất như: Nồng độ acid thủy phân saponin, thời gian

chiết, thời gian thủy phân.

 Khảo sát nồng độ dung dịch HCl sử dụng:

Mục đích sử dụng dung dịch HCl là để thủy phân saponin thu được thành

sapogenin (cắt bỏ phần đường) nhằm tạo thuận lợi cho quá trình tinh chế trong

quy trình xử lý mẫu, đồng thời thuận lợi cho quá trình phân tích bằng HPLC.

Chúng tôi khảo sát 2 mức nồng độ acid thủy phân: dung dịch HCl đặc và

dung dịch HCl ½ (pha loãng 2 lần từ HCl đặc). Kết quả được trình bày ở

bảng 3.2.

Bảng 3.2 – Nồng độ acid oleanolic thu được khi thay đổi

nồng độ acid thủy phân

Khối lượng dược liệu

2,5 gam bột dược liệu

1,25 gam cao khô dược liệu



Nồng độ acid sử dụng



Nồng độ acid oleanolic thu

được (µg/ml)



HCl đặc



17,30



HCl ½



34,20



HCl đặc



23,21



HCl ½



40,27



Kết quả thu được ở trên cho thấy sử dụng HCl ½ cho hiệu quả tốt hơn (đối

với cả bột dược liệu và cao khô dược liệu), do đó chúng tôi sử dụng chiết bằng

MeOH rồi acid hóa bằng HCl ½ cho các khảo sát tiếp theo.

 Khảo sát sự thay đổi thời gian chiết với methanol và thủy phân với dung

dịch HCl ½

Lựa chọn quy trình phân tích thu được giá trị nồng độ acid oleanolic cao

nhất (trên cùng một mẫu thử với khối lượng như nhau) trong thời gian ngắn nhất.



32



Khảo sát thời gian chiết với Methanol: 1h; 1,5h; 2h; 2,5h; 3h; 3,5h và cố

định thời gian thủy phân với HCl là 2h. Kết quả cho thấy thời gian chiết với

methanol là 3h cho đáp ứng tương tự như 3,5h. Do đó, chúng tôi lựa chọn thời

gian chiết methanol là 3h cho các khảo sát tiếp theo.

Khảo sát thời gian thủy phân bằng dung dịch HCl ½: Cố định thời gian chiết

với methanol 3h và thay đổi thời gian thủy phân với HCl là 1h; 1,5h; 2h; 2,5h;

3h; 3,5h. Kết quả cho thấy thời gian thủy phân với HCl là 3h cho đáp ứng tương

tự như 3,5h.

Do đó, chúng tôi lựa chọn chiết mẫu thử bằng methanol trong 3h sau đó

thủy phân bằng dung dịch HCl ½ trong 3h.

Kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.1.

Bảng 3.3 – Nồng độ acid oleanolic thu được khi thay đổi

thời gian chiết và thủy phân

Bột dược liệu

Cố định thời gian

thủy phân HCl (2h)

Thời

gian

chiết

(giờ)



Cao dược liệu



Cố định thời gian

chiết methanol (3h)



Nồng độ

(µg/ml)



Thời

gian thủy

phân

(giờ)



1,0



18,62



1,5



Cố định thời gian

thủy phân HCl (2h)



Nồng độ

(µg/ml)



Thời

gian

chiết

(giờ)



1,0



26,24



27,89



1,5



2,0



34,24



2,5



Cố định thời gian

chiết methanol (3h)



Nồng độ

(µg/ml)



Thời

gian thủy

phân

(giờ)



Nồng độ

(µg/ml)



1,0



20,46



1,0



33,43



34,23



1,5



32,70



1,5



45,21



2,0



43,34



2,0



40,24



2,0



52,09



39,45



2,5



49,80



2,5



47,90



2,5



58,80



3,0



43,40



3,0



54,04



3,0



52,17



3,0



61,00



3,5



43,45



3,5



54,10



3,5



52,16



3,5



61,18



33



Sự thay đổi nồng độ acid oleanolic khi

thay đổi thời gian chiết xuất

Nồng độ acid oleanolic (µg/ml)



70

60

50



1 giờ

1,5 giờ



40



2 giờ



30



2,5 giờ

3 giờ



20



3,5 giờ



10

0



A



B



C



D



Hình 3.1 – Kết quả khảo sát thời gian chiết acid oleanolic

Trong đó:

 A: cố định thời gian thủy phân 2h, thay đổi thời gian chiết trên mẫu bột DL

 B: cố định thời gian chiết 3h, thay đổi thời gian thủy phân trên mẫu bột DL

 C: cố định thời gian thủy phân 2h, thay đổi thời gian chiết trên mẫu cao DL

 D: cố định thời gian chiết 3h, thay đổi thời gian thủy phân trên mẫu cao DL

(DL: dược liệu)

Từ các kết quả khảo sát thu được, chúng tôi lựa chọn được các điều kiện xử

lý mẫu như sau:

 Lựa chọn quy trình 2 để xử lý mẫu

 Sử dụng dung dịch HCl ½ để thủy phân saponin thành sapogenin

 Thời gian chiết với MeOH là 3h và thời gian thủy phân với dung dịch

HCl ½ là 3h



34



3.1.3. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

- Cột sắc ký: Chúng tôi tiến hành khảo sát trên các cột:

 Cột Inertsil ODS (250 × 4,6 mm; 5 µm)

 Cột Germmini Luna C18 (250 × 4,6 mm; 5 μm)

Chúng tôi thấy cột Inertsil ODS (250 × 4,6 mm; 5 μm), nhiệt độ cột 400C là

phù hợp, có khả năng tách tốt và chọn lọc acid oleanolic trong mẫu phân tích.

- Pha động: Khảo sát khả năng tách acid oleanolic với các hệ pha động sau:

 MeOH : H2O (95 : 5)

 MeCN : dung dịch H3PO4 0,1% (MeCN 60 – 70 – 80%)

Cùng với tốc độ dòng 1,2 ml/phút

Kết quả chúng tôi thu được các sắc ký đồ sau.



Hình 3.2 – Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic

với pha động MeOH : H2O (95 : 5)



35



(a)



(b)



(c)



Hình 3.3 – Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic với pha động

MeCN : H3PO4 0,1% có tỷ lệ khác nhau

a) MeCN : H3PO4 0,1% = 60 : 40

b) MeCN : H3PO4 0,1% = 70 : 30

c) MeCN : H3PO4 0,1% = 80 : 20



36