Độ phù hợp của hệ thống sắc ký
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.62 MB, 101 trang )
Mẫu acid oleanolic chuẩn nồng độ 5 μg/ml: tiến hành như mục 3.2.1
Mẫu thử: Bao gồm mẫu dược liệu đinh lăng và mẫu cao khô đinh lăng,
tiến hành như mục 3.2.1
- Tiến hành sắc ký các mẫu trên theo điều kiện được trình bày ở mục 3.1.4,
thu được kết quả như sau:
Hình 3.8 – Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá tính chọn lọc)
Hình 3.9 – Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic nồng độ 5 µg/ml
44
Hình 3.10 – Sắc ký đồ mẫu cao khô đinh lăng
Hình 3.11 – Sắc ký đồ mẫu dược liệu đinh lăng
45
Nhận xét:
- Tại thởi điểm từ 26 đến 30 phút:
Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không thấy xuất hiện pic.
Trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử đều xuất hiện một pic với
thời gian lưu khoảng 28 phút. Do đó có thể kết luận pic ứng với thời
gian lưu 28 phút là pic của acid oleanolic.
- Pic acid oleanolic trên các sắc ký đồ cân đối, rõ nét, tách riêng biệt. Vậy
phương pháp có tính chọn lọc với acid oleanolic.
Khẳng định tính chọn lọc của phương pháp bằng phương pháp
HPLC – MS/MS
Do acid oleanolic không có cực đại hấp thụ UV đặc trưng do đó không thể
sử dụng phương pháp chồng phổ UV (thông thường được sử dụng đối với
phương pháp HPLC – UV) để khẳng định tính chọn lọc của phương pháp.
Vì vậy, để góp phần khẳng định một cách chắc chắn tính chọn lọc của
phương pháp, chúng tôi tiến hành phân tích các mẫu trắng, mẫu thử và mẫu
chuẩn bằng phương pháp đã chọn, tách lấy phân đoạn chứa acid oleanolic (từ
khoảng 26 – 30 phút), tiến hành phân tích bằng phương pháp HPLC – MS/MS
với điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ như tham khảo ở tài liệu [38] như
sau:
Điều kiện sắc ký
- Cột: Germmini Luna C18e (250 x 4,6 mm; 5µm)
- Pha động: MeOH : MeCN : isopropanol : dung dịch acid acetic 2mM
(5:3:1:1)
- Thể tích tiêm: 10 µl
46
Điều kiện khối phổ
- Phổ khối 2 lần (MS/MS)
- Nguồn ion hoá: ESI +
Bảng 3.6 – Điều kiện khối phổ
Thông số
Giá trị
Thế của nguồn ion (V)
3200 V
Nhiệt độ bay hơi dung môi (0C)
1000C
Áp suất khí mang (psi)
20 psi
Áp suất khí bổ trợ (psi)
5 psi
Áp suất khí làm sạch nguồn (psi)
1 psi
Nhiệt độ mao quản (0C)
3600C
Thế hội tụ ion (V)
96 V
Ion ban đầu (m/z)
m/z = 455,5
Thế phân mảnh ion (V)
52 V
Ion tạo thành (m/z)
m/z = 406,8
Kết quả thu được như sau:
47
(a)
(b)
Hình 3.12 - Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic
phân tích bằng LC – MS/MS
a) Chế độ quét toàn thang (TIC)
b) Chế độ quét chọn lọc ion (SIM)
48
(a)
(b)
Hình 3.13 - Sắc ký đồ mẫu cao khô đinh lăng phân tích bằng LC – MS/MS
a) Chế độ quét toàn thang (TIC)
b) Chế độ quét chọn lọc ion (SIM)
49
(a)
(b)
Hình 3.14 - Sắc ký đồ mẫu dược liệu đinh lăng phân tích bằng LC – MS/MS
a) Chế độ quét toàn thang (TIC)
b) Chế độ quét chọn lọc ion (SIM)
50
Hình 3.15 - Sắc ký đồ mẫu trắng phân tích bằng LC – MS/MS
(chế độ quét toàn thang - TIC)
Nhận xét:
Ion ban đầu có m/z = 455,5 ứng với phân tử acid oleanolic (M = 456,7) và
ion tạo thành có m/z = 406,8.
Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại thời điểm 4,5 phút không xuất hiện pic ứng
với ion ban đầu có m/z = 455,5 và ion tạo thành có m/z = 406,8. Trái lại, trong
mẫu chuẩn và các mẫu thử đều xuất hiện pic này.
Do vậy, có thể khẳng định một cách chắc chắn hơn nữa pic tại vị trí 28 phút
trên sắc ký đồ là pic của acid oleanolic. Do vậy phương pháp có tính chọn lọc
cao đối với phân tích acid oleanolic.
3.2.4. Tính tuyến tính và khoảng nồng độ
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn trong MeOH có nồng độ:
5 – 10 – 20 – 25 – 35 (μg/ml) như mục 3.2.1
Tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn trên. Thiết lập phương trình hồi quy biểu
diễn sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic. Kết quả được
trình bày trong bảng 3.7, hình 3.16 và hình 3.17.
51
Hình 3.16 – Sắc ký đồ các mẫu acid oleanolic chuẩn nồng độ 5 - 35 µg/ml
Bảng 3.7 – Sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ acid oleanolic
Nồng độ acid oleanolic (μg/ml)
5
10
20
25
35
Diện tích pic (mAU.s)
26,2
53,1
111,1
140,3
188,3
Diện tích pic (mAU.s)
Phương trình hồi quy: S = 5,475 C – 0,233 (S: diện tích pic, C: nồng độ acid oleanolic )
Hệ số tương quan hồi quy: r = 0,9991
250
S = 5,475 C - 0,233
r = 0,9991
200
150
100
50
0
0
10
20
30
40
Nồng độ acid oleanolic (μg/ml)
Hình 3.17 – Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic
và nồng độ acid oleanolic
52
