PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.12 MB, 62 trang )
Mẩu đối chứng
Mẩu
Đơn vị hoạt tính enzyme trong lml dung dịch enzyme được tính theo
200pl cysteine 0,02M
200pl cysteine 0,02M
công thức sau:
700pl đệm Mcllvain pH
700|Lil đệm Mcllvain
v
=
7
=7
x* *
Luận văn tốt nghiệp Đại học nămpH
2012
Trường Đại học cần Thơ
T
T x V e x I0'3
i
1
Trong
đó:
ủ 37°c, 20 phút
ủ 37°c, 20 phút
TU:ihoạt tính enzyme (TU/ml)
I
Bổ sung 3000pl TCA 15%
BỔ sung 3000pl casein
X: nồng độ tyrosine (pmol/ml)
1%
ị
: thể37°c
tích tổng của dung dịch phản ứng (4ml) ị
Lắc ủ 10vhhphút,
Lắc Ü 10 phút, 37°c
i gian phản ứng (10 phút)
T: thời
Bổ sung 3000jul casein 1%
ị
VE: thể tích enzyme (lOOpl) k: hệ số pha
Bổ
sung
3000pl
TCA
ị
15%
loãng
Ổn định 4°c, 10 phút
Nồng độ tyrosine
(X) trong công thức trên được xác định
ị dựa vào đường
ị
Ón
định
4°c,
10
chuẩn Tyrosine. Lọc
phút
- Xây dựng đường chuẩn Tyrosine
^ ịđược pha trong dung dịch HC1 0,2N.
ị
Tyrosine
Đo độ hấp thụ ở 280nm
Lọc
1.1.2.3
Tính toán kết quả
ị
Đo độ hấp thụ ở
Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa dung dịch tyrosine chuẩn với nồng độ
tăng dần tử 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; l,2|umol/ml. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Lắc đều các ống nghiệm trên máy Vortex. Sau đó tiến hành đo OD của
Luận280nm.
văn tốt nghiệp Đại học năm 2012
Trường Đại học cần Thơ
các ống nghiệm ở bước sóng
Tyrosi
ne
0,
0,
0,
0,
0,
0,
1,
1,
0
1
2
3
4
6
8
0
2
(gmol/
ml)
OD
0,22 0,36 0,46 0,69 0,92
1,1
1,3
0 0,12
(280n
8
5
3
7
2
0
24
28
m)
Từ kết quả đo OD, ta thiết lập được mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ
Tyrosine trong dung dịch.
Hình 1: đưòmg chuẩn Tyrosine
1.2 PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
Nguyên tắc
Hàm lượng protein được xác định dựa trên phản ứng tạo màu giữa
protein có trong dung dịch với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue. Cường độ
màu của hỗn họp phản ứng ở bước sóng 595nm tỷ lệ thuận với hàm lượng
protein trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung dịch
protein nghiên cứu với thuốc thử Coomassie Brilliant Blue, dựa vào đường
chuẩn của protein tinh khiết Bovine Serum Albumin (BSA) với thuốc thử này
tính được lượng protein của mẫu nghiên cứu.
1.2.1
1.2.2
Tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị hoá chất
Chuẩn bị thuốc thử bằng cách hoà tan lOOmg Coomassie Brilliant Blue
G-
1.2.2.1
Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012
Trường Đại học cần Thơ
250 vào trong 50ml ethanol (96%, v/v). Sau đó thêm vào 100ml H3PO4
(85%, w/v) và dẫn nước cất đến 1 lít.
1.2.2.2
Các bước tiến hành thí nghiệm
Bật máy Spectrophotometer và cho khởi động ít nhất 10 phút.
Dùng micropippet lấy chính xác 20|il mẫu cho vào cuvette nhựa loại lml.
Thêm vào lml thuốc nhuộm màu, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong
thời gian 15 phút.
Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595nm. Đối chiếu với đường chuân ta xác
định được hàm lượng protein có trong mẫu.
- Xây dựng đường chuẩn protein
Chuẩn bị dãy ống nghiệm chứa dung dịch BSA chuẩn với nồng độ tăng
dần từ 0,03; 0,12; 0,18; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 và lmg/ml. Tiến hành xác
định hàm lượng protein của các dung dịch nói trên bằng phương pháp Bradford.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Ghi nhận giá trị OD của các dung dịch nói trên ở bước sóng 595nm.
BSA
OD
0,03
0,030
0,12
0,101
0,123
0,18
0,3
0,180
0,4
0,279
0,5
0,6
0,374
0,454
0,7
0,8
0,528
0,588
0,9
1
0,631
0,700
Từ kết quả đo OD, ta thiết lập được mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ
BSA trong dung dịch
Nồng độ BSA
Hình 2: đường chuẩn
PHỤ LỤC 2: KÉT QUẢ THỐNG KÊ
1. Thí nghiệm 1
1.1 Hoạt tính protease (TU/ml)
c
1n
12-
Analysis Summary
Dependent variable:
Hoat
Luận văn
tốt nghiệp Đại học năm 2012
Trường Đại học cần Thơ
tinh protease Factors:
Thanh phan MT
pH
Selection variable: Thanh phan MT
Number of complete cases: 72
Analysis of Variance for HT Protease - Type III
Sums of Squares
Mean
FPSum of
Source
Df
Squar
Rati
Valu
Squares
e
o
e
MAIN
EFFECTS
A:TP moi
1.01135
0.505
109.
0.00
2
truong
674
15
00
B: pH
1.28398
3
0.427
92.3
0.00
995
8
00
INTERACTION
S
AB
0.691756
0.115
24.8
0.00
6
293
9
00
0.004
RESIDUAL
0.277968
60
6328
TOTAL
3.26506
71
(CORRECTED)
Multiple
for HT
TP
Range Tests Protease
mo truong
Method: 95.0 percent LSD
TP moi
Cou
LS
Homogeneou
truong
nt
Mean
s Groups
2
24
0.6255
X
1
24
0.7515
X
3
24
0.915
X
1-2
*0.126
0.0393031
3Cont
*-0.1635
0.0393031
Diffe
+ /3 *-0.2895
0.0393031
Multiple Range Tests for HT Protease by pH
Method: 95.0 percent LSD
pH
Count
LS
Homog Groups
Mean
eneou
0.64266
3
18
X
7
0.64733
X
6
18
3
4
0.79733
X
18
3
5
0.96866
X
18
7
Contr
Difference
+/- Limits
ast
3-4
*-0.154667
0.0453833
3-5
*-0.326
0.0453833
3-6
0.0453833
0.00466667
*4-5
0.0453833
0.17133
4-6
*0.15
0.0453833
*0.3213
0.0453833
33
