1 Sơ LƯỢC VỀ ENZYME PROTEASE

Trong cơ the protein thực phẩm được phân giải ở bộ máy tiêu hóa bởi các

enzyme phân giải protein, đầu tiên là pepsin trong dịch dạ dày và sau đó là các

protease được tiết ra ở tuyến tụy và từ các tế bào ở màng nhầy thành ruột. Các

acidamin tự do, các peptid ngắn được hấp thụ và đi qua các tế bào hình lông ở

thành ruột. Phần lớn các peptid được hấp thụ bị thủy phân ở các tế bào thành

ruột. Các acid amin được hấp thụ sẽ đi vào gan và sau đó tham gia vào quá trình

chuyển hóa.

Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều

loại thực phấm. Quá trình này có thế được thực hiện nhờ chính protease của

thực phấm đó hoặc do các protease vi sinh vật được đưa vào trong quá trình chế

biến thực phâm.

Trong nhiều trường họp các tính chat protein của thực phâm được cải

thiện khi thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc nhờ các enzyme protease. Sự thủy

phân hạn chế có tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng

tính hòa tan và khả năng khuếch tán đến bề mặt phân chia).

Hình 2: cấu trúc không gian enzyme protease

2.1.2

Phân loại enzyme protease vi sinh vật

Protease (peptidase) thuộc phân lóp 4 của lớp thứ 3 (E.c.3.4) trong hệ

thống phân loại các nhóm enzyme.

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.

2.1.2.1

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptid, exopeptidase được phân

chia thành hai loại:

- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu nitơ tụ' do của chuỗi

polypeptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid.

- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon của chuồi

polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid.

2.1.2.2

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành

bốn nhóm:

- Sehne protease: là những protease chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung

tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của

enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: Chymotrypsin và subtilisin. Nhóm

Chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như Chymotrypsin, trypsin,

elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như Suhtilisin



Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng

kiềm tính và thế hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

- Cysteine protease: các protease chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động.

Cysteine protease bao gồm

thực

như

papayin,

một Đại học cần Thơ

Luậncác

vănprotease

tốt nghiệp

Đạivật

học

năm

2012 bromalin,Trường

vài protease động vật và protease ký sinh trùng. Các cysteine protease thường

hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

- Aspartic protease: hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Nhóm

pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, rennin.

Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và

thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.

- Metallo protease: là nhóm protease được tìm thấy ớ vi khuẩn, nấm mốc cũng

như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động vùng

pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.

2.1.2.3

Dựa veto khả năng hoạt động ở các giá trị pH khctc nhau

Chia làm 03 loại protease acid, protease trung tính và protease kiềm.

- Protease acid: loại protease này được thu nhận từ nấm mốc màu đen như:

Aspergillus niger, Aspergillus axvamori, Aspergillus saitoi. pH hoạt động của

protease nấm mốc này là 2,5 -T 3,0.

- Protease trung tính: loại này có ở rất nhiều loại nấm mốc khác nhau, chủ yếu là

ớ các loại nấm mốc có màu vàng như: Aspergillus oryzae, Aspergillus flcivus,

Aspergillus fumigatus, Aspergillus tericole. Ngoài nấm môc ra, protease trung

tính còn tìm thây ở vi khuân Bacillus mesentericus.

- Protease kiềm: tìm thấy nhiều ở nấm men. Tuy nhiên việc tạo ra protease acid,

trung tính và kiềm còn phụ thuộc rất nhiều vào thành phần môi trường hoặc cơ

chất mà chúng tác dụng. Đã có nhiều trường hợp thí nghiệm cho thấy thành

phần môi trường làm thay đổi hẳn đặc tính của protease.

2.1.3

Động học của enzyme

2.1.3.1

Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme

Nghiên cứu động học của enzyme là nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu

tố: nồng độ cơ chat, enzyme, pH môi trường, nhiệt độ, các chất kìm hãm... đến

tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác. Việc nghiên cứu động học enzyme sẽ cho

ta biết được các vấn đề sau đây:

- Có thế biết được cơ chế phân từ của sự tác động của enzyme.

- Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt năng lượng của quá trình

enzyme.

- Thấy được vai trò quan trọng cả về mặt lý luận lẫn thực tiễn: khi lựa chọn các

đơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối với

hoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến



hoạt động của chúng.

Là điều kiện cần thiết đế thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme, vì người ta

cần phải kiếm tra về mặt năng lượng bằng cách xác định có hệ thống hoạt động

của chế phẩm enzyme trong

tinh

chế.

Luậncác

văngiai

tốtđoạn

nghiệp

Đại

học năm 2012

Trường Đại học cần Thơ

2.1.3.1

Anh hưởng của nong độ cơ chất

a. Phưong trình động học Michalelis - Menten

Năm 1913 hai nhà khoa học Leonom Michalelis và Maud Menten đưa ra

mô hình động học đế giải thích phản ứng xúc tác bởi enzyme và lập phương

trình phản ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng, nồng độ cơ chất và enzyme.

Mô hình chuyển hoá của phản ứng enzyme với một cơ chất như sau:

-



E + S^==±ES<



>P + E



Trong đó: ki, k.Ị, kcat: là những hằng số của các phản

ứng E: là enzyme S: là cơ chất

ES: phức hợp enzyme - cơ

chất Etot: nồng độ enzyme ban

đầu

Giả sử nồng độ enzyme ban đầu cũng là nồng độ cơ chất ớ trạng thái cân

bằng của phản ứng, nếu bỏ qua phản ứng ngược p + E -» ES

Tốc độ phản ứng tại thời điểm bắt đầu phản ứng: V = dP /dt = k. ' [ES]

Phản ứng xấp xỉ trạng thái ốn định (Steady - State): [ES] là hang so

Tốc độ xuôi chiều = tốc độ ngược chiều

K[S][E] = K [s](£„„ -[ES]) = (*_, H J[ES]

«•M ]£»=(*-,+*«+MS])[ES]

5



o[ES] = [S]£„/(if„+[S])

Với

Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả enzyme đều tham gia phản ứng

tạo phức hệ ES ta có: [ES] = Etat, khi phản ứng này đạt tốc độ cực đại Vmax =

kcatEtot

y = L, [ES] = k„ [S}E n l l(K, +[s])v = [5]/(AT. + [$])(*)

Phương trình (*) là phương trình Michaelis - Men ten. Phương trình này

phản ánh tương quan định lượng giữa tốc độ ban đầu của phản ứng V, tốc độ

cực đại của phản ứng vmax, nồng độ cơ chất ban đầu [S] và hằng số Km.



V



Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012



Trường Đại học cần Thơ



Hình 3: Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis - Menten

(Nguồn: Nguyen Đức Lượng, 2004)

Những trường họp giới hạn của phương trình Michaelis Menten V = kcat[S]Etot/(Km+[S]) = Vmax[S]/

(Km+[S])

Trong trường họp:

[S] » Km: phản ứng có dạng s —> p

V ~ V......= k R

v v max — J'-catMot

[S] « Km: phản ứng có dạng E + S —> P + E

V ~ (kcat/Km)[S][E]

kcat/Km ~ 109/ (M

see)

[S] = Km

V ~ (l/2)Vmax = (l/2)kcatEtot b. Ý nghĩa của hằng số



Michaelis - Menten

Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis, chính là giá trị của nồng độ cơ

chất khi tốc độ phản ứng bằng Vi tốc độ cực đại. Km có đơn vị là Molar, khi [S]

= Km thì V = Vmax/2 và ngược lại.

Hang so Michaelis là một hằng số rất quan trọng. Nó xác định ái lực của

enzyme với cơ chất. Km càng nhỏ thì ái lực càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao

vì thế tốc độ cực đại vmax đạt ở nồng độ cơ chất thấp.

(kcat/Km) là hằng số tốc độ phản ứng hai phân tử hiệu quả tại nồng độ

cơ chất thấp. Khi (kcat/Km) ~ 109 chỉ ra rằng sự xúc tác gần như hoàn

chỉnh: mỗi khi cơ chất gặp enzyme hầu như đều chuyển thành sản

phẩm.



c. Phương trình Line Weaver

V = Vmax[S]/(Km + [S])

Nghịch đảo 2 vế phương trình:

Luận văn tôt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học cần Thơ

l/v = (l/vmax) + (Km/Vmax)*(l/[S])

Đây là phương trình được Line Weaver và Burk đưa ra vào năm 1943 có

dạng y = ax + b là phương trình đường thẳng.

Nếu vẽ đồ thị đường thẳng sẽ cắt trục tung ở 1/Vmax và cắt trục hoành ở

- 1/Km và độ nghiêng bằng Km/Vmax. Từ phương trình trên ta dễ dàng xác định

Km và Vmax trong các thí nghiệm.

(Nguồn: Nguvễn Đức Lượng, 2004)

Hình 4: Đồ thị biểu diễn

2.2 GIỚIphương

THIỆU

VÈLine

Cơ CHẤT

trình

Weaver

2.2.1

Giói thiệu về CO’ chất gelatine

Cơ chất cảm ứng được xem như yếu tố rất quan trọng dùng đế điều khiển

quá trình sinh tông họp enzyme.

Gelatine có sẵn trong tự nhiên nhưng nó được tìm thấy từ protein

collagen gốc bằng quá trình phá hủy cấu trúc bậc hai hoặc cao hơn ở các nhiệt

độ khác nhau của quá trình thủy phân polypeptide có trong xương và da.

Gelatine là các polypeptide cao phân tử dẫn xuất từ collagen, là thành

phần protein chính trong các tế bào liên kết của nhiều loại động vật. cấu tạo là

một chuỗi acid amin gồm 3 acid amin chủ yếu là glycine, proline và

hydroproline.Trong phân tử gelatine, các acid amin liên kết với nhau tạo chuỗi

xoắn ốc có khả năng giữ nước. Báng 1: Thành phầiyacid amin cỏ trong gelatỉne

Acid amin



Glycine

27%

Các acid amin khác

10%

(Nguồn: http://baisians. violet. vn/present/saine/entiy id/3232177)

2.2.2

Giói thiệu về CO’ chất casein

Luận văn tôt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học cần Thơ

Casein là protein chủ yếu trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa.

Chúng tồn tại dưới dạng micelle. Casein là những protein có tính acid vì trong

phân tử của chúng rất giàu các acid glutamic và acid aspartic. Tất cả các casein

đều được phosphoryl hoá với những mức độ khác nhau trên gốc serin và

threonine. Casein có điểm đẳng điện pl = 4,6. Casein trong sữa có nguồn gốc

từ những chủng bò khác nhau nên có cấu trúc bậc 1 khác nhau. Casein trong

sừa có 4 dạng chính: casein as] và casein aS2, casein p, casein K.

- Casein as]: phân tử lượng khoảng 23.000Da, có 199 gốc acid amine. Do sự

phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân

tử loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước.

- Casein as2: phân tử lượng 25.000Da, có 207 gốc acid amine, có tính ưa nước

cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm phosphoryl

và gốc cation nhất.

- Casein P: phân tử lượng khoảng 24.000Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưa

béo cao nhất. Phân tử casein p gồm 10% cấu trúc xoắn a, 13% cấu trúc lá xếp

p và 77% cấu trúc không trật tự.

- Casein K: phân tử lượng khoảng 19.000Da, có 169 gốc acid amine. Loại này chỉ

chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực. Đầu amino của phân tử

protein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước. Casein K gồm 23% vùng

xoắn a, 31 % vùng lá xếp p và 24% vùng vòng cung p.

Báng 2: Thành phần các acid amin trong casein_________________________

Acid amin

Tỷ lệ (%)

Glutamic acid

20,2%

Proline

10,2%

Leucine

8,3%

Lycine

7,4%

Valine

6,5%

Aspartic acid

Serine



6,4%

5,7%



Tyrosine

Tsoleucine

Phenylalanine

Threonine



5,7%

5,5%

4,5%

4,4%



Arginine

3,7%

Histidine

2,8%

Alanine

2,7%

Methionine

2,5%

Glycine

2,4%

Tryptophane

11%

Cystine

0,3%

(Nguồn: http://www.casein.com/products.ìĩtm)

2.2.3 Giới thiệu về cơ chất Bovỉne Serium Albumin (BSA)