5 SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE

Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012



Trường Đại học cần Thơ



Chủng mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triến

rất mạnh (chiều ngang 5 -ỉ- 7|Lim), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế

bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.



Hình 8: Nấm mốc Aspergillus oryzae sau khi ủ 4 ngày



Hình 9: Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiổn vỉ x Điều kiện phát triển

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%.

Độ ấm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme: 55 -7- 58%.

Độ ẩm không khí: 85 95%.

pH môi trường: 5,5 + 6,5

Nhiệt độ nuôi cấy: 27 -ỉ30°c

2.5.2



Môi trường nuôi



cấy 2.5.2. ỉ Nguyên liệu

Môi trường sử dụng nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme thường là

cám gạo hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc nảy mầm. Trong các loại nguyên liệu

trên thì cám gạo, cám mì thường được sử dụng nhiều hon cả. Hai loại cám này

có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển. Mặt khác, khi tạo

môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để đảm bảo khối kết



Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012



Trường Đại học cần Thơ



dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên

liệu. Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonium, phosphat...



t"•1ro

\Ó



Trong nhiều trường họp, đế tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta

thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20 -r 25%. Thực chất, việc cho trấu vào

là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống đế không khí

có thế lưu thông trong lòng môi trường.

Báng 4: Thành phần dinh dưõiĩg của cám (Nguyễn Dửc Lượng và ctv, 2004)

---—----------, -.../

Thành phần dinh

Hàm

lưọng

Hàm lượng

Thành phần dinh

dưõng

dưõng

350 -T

Năng lượng

Tro

6,0 -T 6,5 %

426kcal

Nước

12-T 14%

Canxi

30 -r 32mg

%

4,5 -T 4,6mg

Protein thô

10-r 12,2%

Phospho

%

Lipid

20 -r 22,7% Sắt

10 -T 14mg

%

Glucid tổng số

40,3 - 42%

Vitamin B]

0,96-ỉ- lmg

%

Cellulose

2.5.2.2 Chuân bị môi trường nuôi cấy

Trong quá trình chuẩn bị môi trường, điều quan trọng nhất là tạo được

độ ẩm thích hợp. Độ ẩm thích họp cho nhiều vi sinh vật khi nuôi cấy trong môi

trường cám là 60%w. Độ ẩm vượt quá 60%w thường tạo điều kiện cho nhiều vi

khuẩn phát triển, khi đó dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ. Neu độ ấm < 60%w

(thường 45 -T 50%W) thường gây hiện tượng tạo nhiều bào tử nấm sợi và như

vậy thì enzyme thu được sê giảm hoạt tính rất mạnh.

Sau khi chuẩn bị xong môi trường, ta tiến hành thanh trùng môi trường

để tiêu diệt các vi sinh vật lạ nhiễm vào môi trường mà có thế ức chế sự phát

triến của giống vi sinh vật mà ta sẽ nuôi cấy. Thông thường, môi trường sẽ được

thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 121°c trong thời gian 15 -T 30 phút.

Môi trường nuôi cấy sẽ được cho vào bình tam giác và tiến hành trộn

giống vi sinh vật vào khối môi trường sao cho thật đều. Thời gian nuôi cấy nấm

sợi đê thu nhận enzyme vào khoảng 36 -r 60 giờ.

Phưong pháp nuôi cấy bề mặt

Đe nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sản xuất enzyme protease ta

lựa chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn. Phương pháp nuôi

cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt

môi trường hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm. Thông thường, môi trường

dạng rắn vói nguyên liệu chính là bột cám mì, bã củ cải, bột bắp nghiền, hạt

thóc nảy mầm, trấu và bổ sung một số chất dinh dưỡng khác (amon Sulfat,

amon clorua, amon phosphat). Phương pháp này phát triển rất mạnh từ những



2.5.4



Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012



Trường Đại học cần Thơ



năm 1970 đến nay. Những ưu điểm cơ bản của phương pháp nuôi cấy bề mặt:

- Dề thực hiện, quy trình công nghệ đơn giản.

- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so

với nuôi cấy chìm.

- Sản phấm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo

quản.

- Khi bị nhiễm vi sinh vật lạ ta rất dễ dàng xử lý.

2.5.4.1

Quy trình

Nguyên liệu

ị'

Trộn, làm ẩm

ị

Thanh trùng bằng nhiệt

ị

Làm nguội, làm tơi

ị

Trộn giống vsv <--------- Giống vi sinh vật

ị

Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy

ị

Nuôi cấy, theo dõi

ị

Thu nhận chế phâm enzyme thô Hình 10: Quy

trình nuôi cấy vi sinh vật bằng phưong pháp bề mặt

Thuyết minh quy trình

a. Nguyên liệu

Đặc điếm của giống Aspergillus oryzae giàu các enzyme thủy phân nội

bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinase...), ta rất hay gặp chúng ở các

kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo đã hết nhưng không được

rừa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở bã sắn... Chúng mọc và có khi phát triển thành

lóp mốc, có màu sắc đen, vàng... Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa khi gặp

điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành sợi mốc mới.

b. Kỹ thuật nuôi cấy

Sau khi đã trộn giống, các bình tam giác có chứa mẫu được đặt vào tủ ủ ở

nhiệt độ 30°c vì nấm sợi phát triến thích họp ở nhiệt độ là 28 -T 32°c. Neu nhiệt

độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt đến sự phát triển của nấm

sợi.

Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi

trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ớ một vùng nào đó ít khi

ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường.



2.5.4.2



Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012



-



Trường Đại học cần Thơ



Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36 ^ 60 giờ. Điều

này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và điều kiện môi

trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy.

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng

phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10 -T 14 giờ kế từ thời gian bắt đầu nuôi cấy,

xảy ra sự trương đính bào tử, bắt đầu mọc nấm và hô hấp. Ỏ giai đoạn này

phòng nuôi cấy cần giữ nhiệt độ không dưới 28 -T 30°c đế không kìm hãm sự

phát triển ban đầu của chúng. Trong giai đoạn này có thể xảy ra nhiều biến đổi:

•



Nhiệt độ tăng rất chậm.



•



Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa.



•



Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đối.



•



Khối môi trường còn ròi rạc.



Enzyme mới bắt đầu được hình thành.

Giai đoạn 2: hệ sợi nấm bắt đầu phát triển nhanh, giai đoạn này kéo dài khoảng

14 -r 18 giờ. Nấm mốc phát triển mạnh mẽ, sử dụng một lượng lớn các chất

dinh dưỡng, hô hấp rất mạnh và lượng nhiệt thoát ra nhiều. Trong giai đoạn này

có những thay đổi cơ bản sau:

Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triến rất

mạnh, có thế nhìn rõ được sợi nấm.

•



-



•



•

•



•

•



•



Môi trường được kết lại khá chặt.



•



Độ ẩm môi trường giảm dần.



•



Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thế đạt tới 40 -T 45°c.



•



Các chất dinh dường bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hóa mạnh



của

nấm sợi.

Các enzyme được hình thành và enzyme nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ

được tạo ra nhiều hơn.

Lượng oxy trong không khí giảm và C02 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này

cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29 -ỉ30°c là tốt nhất.

- Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài khoảng 10 -ỉ- 20 giờ. Ớ giai

đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau:

Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm

lại.

Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi

trường xuống còn 20 -T 25 thế tích không khí/thế tích phòng nuôi cấy/1 giờ.



Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012



Trường Đại học cần Thơ



Nhiệt độ nuôi cấy duy trì ở 30°c. Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành

nhiều do đó lượng enzyme sè giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần

thiết đế thu nhận enzyme rất cần thiết.

Ket thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. Chế

phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra

chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong

môi trường). Người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để

đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh.

2.5.5

Thu nhận chế pham enzyme protease thô

Ket thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. Chế

phấm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra

chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong

môi trường).

Tùy theo mục đích sử dụng, ta có thể dùng chế phẩm thô này ngay mà

không cần qua quá trình tinh sạch. Trong những trường họp cần thiết khác, ta

phải tiến hành làm sạch enzyme. Khi enzyme được tách hết nước, sinh khối vi

sinh vật và thành phần môi trường, chúng ở dạng tinh thế, ta thu được chế phấm

enzyme sạch. Chế phẩm enzyme này còn được gọi là chế phẩm enzyme tinh

khiết.

Đe đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh, người

ta thường sấy khô chế phâm enzyme đến một độ ấm thấp. Độ ấm cần đạt sau

khi quá trình sấy kết thúc là nhỏ hơn 10%w. Để đảm bảo hoạt tính enzyme

không thay đổi, người ta thường sấy enzyme ở nhiệt độ 38 40°c. Ỏ nhiệt độ

này enzyme ít bị biến

đổi. Nếu ta sấy ở nhiệt độ cao quá 40°c enzyme rất dễ bị biến tính. Do đó, điều

kiện nhiệt độ trong quá trình sấy phải được thực hiện tuyệt đối chính xác.

2.6 CÁC YÉU TÓ ẢNH HƯỞNG ĐÉN KHẢ NĂNG SINH TỐNG HỢP

ENZYME PROTEASE

2.6.1

Độ ẩm môi trường

Độ âm của môi trường tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc

là 55 -T 58%. Độ ấm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử khoảng

45%. cần giữ cho độ ấm môi tiường không bị giảm trong quá trình phát triến

của nấm mốc.

2.6.2

Ánh hưởng của không khí

Aspergillus oryzcie là sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình

thường khi trong môi tiường có đầy đủ 02. Đe đáp ứng điều kiện nuôi cấy này

môi trường phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2,5 -T 3,0cm, phòng nuôi cấy

phải thoáng.

2.6.3

Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH môi trường

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme của



Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012



Trường Đại học cần Thơ



Aspergillus oryzae là khoảng 28 -T 32°c. Nhiệt độ do nấm mốc tởa ra môi

trường có thể lên đến 40°c hoặc cao hoư. cần giữ cho nhiệt độ môi trường

không xuống dưới 27°c và không quá 36°c.

Thích họp cho Aspergillus oryzae phát triển là môi trường acid yếu 5,5 -r

6,5. Các môi trường tự nhiên từ cám, đậu, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này

nên không cần điều chỉnh. Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu

hoặc mất hăn. Đê khôi phục khả năng này có thê nuôi nâm môc trong ánh sáng

khuêch tán trong một vài thế hệ.

2.6.4

Thòi gian nuôi cấy

Hầu hết các chủng Aspergillus oryzae có hoạt động cực đại của amylase

ở giờ thứ 30 -T 36, rồi sau đó cực đại của protease ở giờ thứ 36 -r 42. Thời gian

nuôi mốc giống thường hết 60 -T 70 giờ.

2.7 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE

2.7.1



ủ ng dụng trong chế biến thực phẩm



Trong công nghiệp thịt

Trong công nghiệp thịt có sử dụng chế phẩm protease để làm mềm thịt.

Ngoài papayin có thế dùng chế phẩm protease của vi sinh vật đế thủy phân một

phần nào đó các protein tham gia trong thành phần của thịt. Ket quả là chất

lượng của các loại thịt được tăng cao, có thể chuyển thịt loại thấp thành thịt có

phâm chất cao. Không những thế thời gian chín của thịt sẽ rút xuống nhiều lần.

2.7.1.2

Trong công nghiệp sữa

Protease không những có khả năng phân ly protein mà còn có khả năng

làm đông tụ sữa. Tính chất của enzyme cũng như của pepsin tù’ lâu đã

được dùng trong

2.7.1.1