2 Ket quả khảo sát ảnh hưởng cùa pH và nhiệt độ lên hoạt tính cùa enzyme protease

p

F11

4



35



0,120

4,5

0,292

5

0,468

5,5

0,600

6

0,738

6,5

0,852

Trung bình 0,512d



40

0,960



45

1,470



50

1,164



55

0,478



1,076

1,572

1,082

0,348

Luận

văn

tốt

nghiệp

Đại

học

năm

2012

1,138

1,604

0,984

0,220

0,850

1,222

1,802

0,200

1,320

1,512

0,724

0,158

1,390

1,354

0,590

0,070

a

l,184b

l,552

0,899°

0,246°



bình

0,839

c0,874

bc

0,883

Trường Đại học cần Thơ

b

0,935a

0,890

b0,85

lbc



Hình 25: Ảnh hưỏng của nhiệt độ lên hoạt tính của protease thep pH

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Tốc độ phản ứng enzyme

tăng khi nhiệt độ tăng nhưng không phải lúc nào tốc độ phản ứng cũng tỷ lệ

thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt

độ nhất định (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Dựa vào kết quả thí nghiệm cho thấy

rằng ở mỗi nhiệt độ và pH khác nhau enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác khác

nhau. Ỏ những nhiệt độ khác nhau hoạt tính enzyme giữa các nghiệm thức khác

biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Nghiệm thức D3 khác biệt so với nghiệm thức

Dl, D2, D4 và D5 ở độ tin cậy 95% và có hoạt tính enzyme trung bình cao nhất

(1,552TU/ml). Tương tự đối với pH, khi thay đối pH thì hoạt tính xúc tác của

enzyme cũng thay đối. pH khác nhau hoạt tính enzyme giữa các nghiệm thức

khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Nghiệm thức C4 khác biệt so với Cl, C2,

C3, C5 và C6 ở độ tin cậy 95% và cho hoạt tính enzyme trung bình cao nhất

(0,935TU/ml).



Từ hình 24 cho thấy khi gia tăng nhiệt độ phản ứng từ 35°c đến 55°c ta

thấy hoạt tính enzyme tăng dần theo nhiệt độ. Nhưng khi nhiệt độ tăng lên đến

45°c thì hoạt tính enzyme trung bình là cao nhất (l,552TU/ml), khi nhiệt độ tăng

cao hơn nữa thì hoạt tính

enzyme

mà 2012

bắt đầu có xu hướng

Luận

văn tốtkhông

nghiệptăng

Đạithêm

học năm

Trường Đại học cần Thơ

giảm mạnh do xảy ra hiện tượng biến tính nhiệt của enzyme. Ỏ nhiệt độ 45°c

hoạt tính enzyme trung bình là cao nhất (l,552TU/ml) khác biệt có ý nghĩa ở độ

tin cậy 95%. Như vậy nhiệt độ 45°c được xem là nhiệt độ tối ưu của phản ứng

enzyme trong thí nghiệm này. Phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Đức Lượng

(2004), phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 -ỉ- 50°c. Neu đưa

nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm và dẫn đến

mức triệt tiêu. Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Từ

hình 24 ta thấy ở nhiệt độ 55°c hoạt tính enzyme trung bình là thấp nhất

(0,246TU/ml) khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% so với nhiệt độ 50°c. Nhiệt

độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim

loại, pH và các chất bảo vệ. Khi nhiệt độ caothường gây cho enzyme mất hoạt

tính.

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme

và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng

rất mạnh đến phản ứng của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Khi pH càng

tăng hoạt tính enzyme tăng dần nhưng đến một giới hạn nào đó hoạt tính

enzyme không tăng nữa mà có xu hướng giảm. Khi pH thay đối thì đồng thời

trạng thái ion hoá enzyme và cơ chất cũng thay đổi, làm quá trình hình thành

phức họp enzyme - cơ chất bị ảnh hưởng dẫn đến việc thay đổi vận tốc phản

ứng. Hình 25 thế hiện hoạt tính xúc tác của enzyme ở những giá trị pH khác

nhau khi tương tác với nhiệt độ. Dựa vào bảng thống kê ta thấy hoạt tính xúc tác

của enzyme protease cao nhất ở pH = 5,5 (0,935TU/ml) khác biệt có ý nghĩa ở

độ tin cậy 95% so với pH = 6 và thấp nhất ở giá trị pH = 4. Vậy pH = 5,5 là giá

trị pH tối ưu cho hoạt động của enzyme. Vượt quá giới hạn này hoạt động của

enzyme sè giảm. Đặc tính này rất có ý nghĩa trong việc tăng phản ứng enzyme,

làm giảm hoặc triệt tiêu phản ứng enzyme.

R2 = 90,6967%

R2 (adjusted for d.f.) = 90,4294% D p i i I D I p H - ĩ 0 Í n o l d p r o t e o s e

* nhiet do + 1,60997 * pH -0,0104952 *

ú Hoat

p l i m otinh

I p H=- ĩ -26,3804

o f m o I d p r +o t e1,06361

ose

nhiet do * nhiet do - 0,0419143 * pH * pH - 0,0257874 * nhiet do * pH

Hình 26: Sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của

enzyme protease Từ đồ thị hình 24, 25 và 26 ta nhận thấy có sự tương tác qua

lại giữa pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme protease, ứng với mỗi



khoảng nhiệt độ enzyme này sẽ có khoảng pH hoạt động và giá trị pH tối thích

khác nhau và ngược lại. Vậy sự tương tác giữa pH và nhiệt độ môi trường xử lý

đế enzyme thế hiện hoạt tính xúc tác tối ưu là ở nhiệt độ 45°c và pH = 5,5.

Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học cần Thơ



4.3 Kết quả khảo sát ánh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính enzyme



protease

Mỗi cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng. Trong thí nghiệm

này ta tiến hành khảo sátLuận

ảnh văn

hưởng

của nồng

cơ năm

chất 2012

đến hoạt tính xúc

tác Đại học cần Thơ

tốt nghiệp

Đạiđộhọc

Trường

của enzyme protease đế tìm ra thông số động học của phản ứng. Cơ chất được

sử dụng ở đây là casein với các mức nồng độ khác nhau từ 0,2

1,4%. Phản

ứng được tiến

hành ở nhũng điều kiện tối ưu của các thí nghiệm trên với thành phần môi

trường 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin ở pH = 5 và phản ứng thuỷ phân được

tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 45°c, pH = 5,5.

Dung dịch sau khi lọc có chứa enzyme protease được đem xác định hoạt

tính theo phương pháp Kunitz với nguồn cơ chất đã chọn. Dựa vào phương trình

Michaelis - Menten tìm được thông số động học của enzyme. Động học của

enzyme có liên quan mật thiết đến tốc độ của phản ứng enzyme theo thời gian,

mối quan hệ giữa enzyme và nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cực đại vmax và

Km.

Trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ửng sẽ gia

tăng. Nhưng khi tốc độ phản ứng đạt cực đại, cho dù tăng nồng độ cơ chất thêm

nữa thì tốc độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo

(Nguyễn Đức Lượng, 2002). Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 8 và hình

27.

Báng 8: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme protease theo nồng độ casein

Nồng độ casein (%)

Hoạt tính (TU/ml)

0,2

0,362d

0,3

0,550cd

0,4

0,620bcd

0,5

0,718abc

0,6

0,746abc

0,7

0,846ab

0,8

0,910a

1,0

0,908a

1,4

0,908a

Két quả thê hiện là hoạt tính của enzyme theo đon vị TU/ml, trên cơ chát là

casein

Các chữ cải khác nhau trong cùng một cột biếu thị sự khác biệt có ý nghĩa về

mặt thống kê ở độ tin cậv 95%.

Động học enzyme được xác định thông qua việc xử lỷ bằng chương

trình SAS và kết quả enzyme protease thành phấm có vmax = l,2548pmol/phút

và Km = 0,3932% và đồ thị phương trình Michaelis - Menten được thể hiện ở



hình 27.

Dựa vào kết quả ở bảng 8 cho thấy, hoạt tính enzyme protease tăng kill

nồng độ cơ chat casein tăng, đường cong biểu diễn quan hệ giữa hoạt tính

enzyme và nồng độ casein

thểvăn

hiệntốt

ở hình

27.Đại học năm 2012

Luận

nghiệp

Trường Đại học cần Thơ