b. Phương pháp cấy nấm mốc

-



thích hợp đế nấm sợi sinh tống hợp enzyme protease mạnh nhất.

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí với 02 nhân tố hoàn toàn ngẫu nhiên với 02

lần

Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học cần Thơ

lặp lại.

Nhân tố A: thành phần môi trường

Ai: 75% cám + 15% trấu + 10% cơ chất A2: 75% cám + 20% trấu + 5%

cơ chất A3: 70% cám + 25% trấu + 5% cơ chất



Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012



Trường Đại học cần Thơ



Nhân tố B: pH môi trường

B,:pH = 3



B3:pH = 5



B2: pH = 4



B4: pH = 6



=>Tổng số mẫu thí nghiệm: 3 x 4 x 2 (lần lặp lại) = 24

mẫu - Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho mỗi mẫu là 30g. Các mẫu được

tiến hành như cách bố trí trên. Mầu thí nghiệm được khảo sát hoạt tính của

enzyme bằng phương pháp Kunitz (phụ lục) với cơ chất casein. Điều kiện thí

nghiệm: cố định mật số nấm mốc 5xl0 6CFU/ml, nhiệt độ 30°c, độ ẩm 60%, thời

gian nuôi cấy 42 giờ và khảo sát hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford

(phụ lục).

Nguyên liệu (30g)

I



Trộn, làm ấm (chỉnh pH (B))



i

Thanh trùng (121°c, 15 phút)



Giống vi sinh

vật



ị

ị

Nhân giống

Làm nguội

ị

ị

Pha loãng

Trộn giống vsv <------Mật số

ị

ủ 30°c, 42 giờ

ị

Thu nhận chế phẩm enzyme thô

ị

Đo hoạt tính enzyme

Hình 19: Quy trình thí nghiệm sản xuất enzyme protease Dựa

vào độ hấp thụ của mẫu đối chúng và mẫu phân tích xác định được hoạt tính

enzyme và hàm lượng protein từ đó tìm ra hoạt độ riêng cao nhất, lấy sử dụng

làm nguồn enzyme cho các thí nghiệm sau.

3.2.22 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên hoạt tỉnh của

enzyme protease

-



Mục đích: tìm hiểu quy luật biến đổi hoạt tính của enzyme protease ở những

điều kiện môi trường khác nhau.

-



Bố trí thí nghiệm



n



Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012

Trường Đại học cần Thơ

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 02 nhân tố.

Nhân tố C: pH

c4: 5,5

c5: 6,0



c2: 4,5

c3: 5,0

Nhân tố D: nhiệt độ



c6: 6,5



D,:35°c



D4: 50°c



D2: 40°c



D5: 55°c



D3: 45°c

Thí nghiệm được lặp lại 02 lần, với mỗi nghiệm thức có 01 mẫu đối

chứng.

=> Tống số mẫu thí nghiệm: 6 X 5 X (2 (lần lặp lại) + 1 (mẫu đối

chứng)) = 90 mẫu.

- Tiến hành thí nghiệm

Chuấn bị dung dịch enzyme từ nghiệm tối ưu ở thí nghiệm 1.

Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme

protease trên co chất là casein.

Tiến hành thí nghiệm như trên, mỗi mẫu đều tiến hành xác định hoạt

tính enzyme bằng phương pháp Kunitz (phụ lục).

3.2.2.3

Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên hoạt tính

enzyme protease

-



Mục đích: xác định động học của enzyme, tìm ra vmax và Km



-



Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí với 01 nhân tố, 02 lần lặp lại.

Mỗi giá trị khảo sát có thực hiện thêm 01 mẫu đối chứng kèm theo.

Nhân tố E: nồng độ cơ chat casein E,:0,2% E4:0,5%

E2:0,3%



E5:0,6%



Eg: 1,0%



E3:0,4%



E6:0,7%



Eọ: 1,4%



E7:0,8%



Tổng số mẫu thí nghiệm: 9 X (2 (lần lặp lại) + 1 (mẫu đối chứng)) = 27 mẫu

-



Tiến hành thí nghiệm:

Tiến hành thí nghiệm như trên, mỗi mẫu đều xác định hoạt tính



enzyme

theo phương pháp Kunitz (phụ lục) với cơ chất casein ở các nồng độ khác nhau,

điều kiện thí nghiệm với pH và nhiệt độ tối un xác định ở thí nghiệm 2.

Dựa vào độ hấp thụ của mẫu đối chứng và mẫu phân tích ta có thế



Luận văn tốt nghiệp Đại học năm 2012



Trường Đại học cần Thơ



xác định được lượng casein bị thủy phân từ đó tìm ra vận tốc của phản ứng.

3.2.2.4

Thí nghiệm 4: khao sát khả năng thuỷ phân của enzyme protease

trên dung dịch acid protein

- Mục đích: tìm hiểu khả năng thuỷ phân của enzyme ở những thời gian thuỷ

phân khác nhau.

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 01 nhân tố

và 2 lần lặp lại.

Nhân to F: thời gian thuỷ phân

Fi: 10 phút



F3: 30 phút



F5: 50 phút



F2: 20 phút



F4: 40 phút



F6: 60 phút



=> Tổng số mẫu thí nghiệm: 6x2 (lần lặp lại) = 12 mẫu.

-



Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị dung dịch acid protein với tỉ lệ 1 : 30 (lg da cá tra : 30ml acid

acetic) ngâm trong 24 giờ. Sau đó tiến hành ly tâm lấy dịch trong và bổ sung

lml dung dịch enzyme protease và tiến hành thuỷ phân ở 45°c ở những thời gian

khác nhau. Mầu được tiến hành như cách bố trí trên. Mầu thí nghiệm được khảo

sát hàm lượng tyrosine sinh ra bằng cách đo dung dịch sau khi thuỷ phân ở bước

sóng 280nm và khảo sát hàm lượng protein trước và sau khi bố sung enzyme

bằng phương pháp Bradford (phụ lục).

Dựa vào độ hấp thụ của mẫu đối chứng và mẫu phân tích xác định

được khả năng thuỷ phân của enzyme.



CHƯƠNG 4 KÉT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả kháo sát ánh hưởng cùa thành phần môi trường và pH môi trường

khác nhau đến quá trình sinh tổng họp enzyme protease

Thành phần môi trường

nuôi

có ảnh

nhiều

đến khả năngTrường

sinh Đại học cần Thơ

Luận văn

tốtcấy

nghiệp

Đạihưởng

học năm

2012

tổng hợp enzyme. Thành phần chính của môi trường nuôi cấy nấm mốc tạo

enzyme protease bằng phương pháp bề mặt là cám gạo. Cám là nguyên liệu

hoàn hảo có thế sử dụng làm thành phần của môi trường để nuôi cấy vi sinh vật

tạo enzyme. Tuy nhiên, sử dụng cám làm nguyên liệu chính nhưng cần cho

thêm 20 -T 25% trấu vào môi trường để tạo độ xốp và tạo nên những khoảng

trống đế không khí lưu thông bên trong môi trường một cách dễ dàng (Nguyễn

Đức Lượng, 2004). Nguồn cơ chất cảm ứng cũng có ảnh hưởng nhiều đến khả

năng sinh tống hợp enzyme. Neu cơ chất thích hợp sẽ tạo điều kiện thuận lợi

cho vi sinh vật sinh tổng họp enzyme có hoạt tính cao nhất.



Hình 20: Môi trường sau khi ủ 42 giờ Hình 21: Dịch lọc thô enzyme

protease

Giá trị pH ban đầu của môi trường nuôi cấy là một trong những nhân tố

có ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng họp enzyme. Mỗi loại vi sinh

vật và enzyme khác nhau cần có giá trị pH tối ưu riêng cho hoạt động sinh tổng

họp đạt được hiệu quả cao nhất. Dung dịch đệm citrate được sử dụng đế pha

loãng nhằm điều chỉnh pH của môi trường về các mức pH cần khảo sát (3, 4, 5,

6), độ ấm môi trường 60%, thanh trùng môi trường, cấy nấm mốc và ủ trong 42

giờ. Kết quả thống kê ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy và pH

ban đầu đối với sự thay đổi hoạt tính tổng enzyme protease và hoạt tính riêng

của enzyme protease được thể hiện ở bảng 5, 6 và hình 22, 23.



Bảng 5: Sự thay đối hoạt tính enzyme (TU/ml) theo thành phần môi

trường và pH môi trường______________________________________

Môi

pH

trường

3

4

5

6

Luận

văn

tốt

nghiệp

Đại

học

năm

2012

AI

0,560

0,814

0,874

0,758

0,752bTrường Đại học cần Thơ

A2

A3

Trung

bình



0,404

0,964



0,616

0,962



0,906

1,126



0,576

0,608



0,643c



0,797b



0,969a



0,647c



0,626°

0,915a



Kết quả thê hiện là hoạt tính của enzyme theo đơn vị TU/ml, trên cơ chất là

casein

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có V nghĩa

về mặt thống kê ở độ tin cậv 95%. Bảng 6: Sự thay đối hoạt tính riêng

(TU/mg) của enzyme theo thành phần

pHmôi trường và pH môi trường________

3

4

5

6

AI

1,155

1,204

1,024

l,124b

1,112

A2

0,770

0,870

1,149

0,931

0,930°

A3

1,200

1,197

1,338

1,011

1 187a

Trung bình l,028bc

l,074b

l,230a

0,989°

Kết quả thê hiện là hoạt tính riêng của enzyme theo đon vị TU/mg

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biêu thị sự khác biệt có V nghĩa



s

3

H

o

N

C

<

«

■



Hình 22: Biến đổi hoạt tính của enzyme theo pH và thành