Sử dụng thuốc cho phụ nữ có thai và cho con bú

16

valproat có thể làm mất tác dụng của thuốc uống tránh thai khi dùng chung.

Liều dùng

Liều dùng (tính theo natri valproat) thay đổi theo tuổi và cân nặng của bệnh

nhân, liều khởi đầu thường là 10 -15 mg/kg/ngày. Liều tối ưu khoảng 20 – 30

mg/kg/ngày, có thể lên đến 50 mg/kg/ngày nhưng phải theo dõi cẩn thận.

1.3.3. Các nghiên cứu về bào chế viên PTKD chứa AV và NV

Để thiết kế dạng PTKD, các dược chất được lựa chọn thường có độ tan trung

bình hoặc hơi khó tan [17]. NV là dược chất có độ tan khá cao (2,5 g/ml), tính thấm

cao (thuộc nhóm I bảng phân loại sinh dược học). Vì vậy, nguyên liệu này sẽ không

phù hợp để bào chế dạng PTKD do khó làm giảm tốc độ hòa tan và làm chậm sự hấp

thu của nó. Mặc khác, tuy có dạng bột tinh thể rắn, nhưng với tính háo ẩm mạnh và

dễ vón cục hoặc chảy lỏng, nên NV cũng không phải là loại nguyên liệu thuận lợi

cho bào chế dạng thuốc viên.

Đối với AV, có độ tan thấp (1,27 mg/ml), quá trình hòa tan do chuyển thành ion

valproat khi thuốc di chuyển xuống môi trường ruột. Độ tan tốt nhất của AV đạt được

trong khoảng pH từ 5 - 8, sau đó giảm dần khi pH tăng cao hơn [28]. Như vậy, nếu

xét về độ tan, AV sẽ thích hợp hơn NV để bào chế dạng thuốc PTKD. Tuy nhiên,

với tính chất dạng lỏng nên nguyên liệu này sẽ gây nhiều khó khăn trong kỹ thuật bào

chế thành dạng thuốc viên .

Để khắc phục các nhược điểm của NV (độ tan cao, tính háo ẩm mạnh), AV

(dạng lỏng) và kết hợp các ưu điểm vốn có của từng thành phần (dạng bột tinh thể

của NV, độ tan phù hợp cho thiết kế dạng PTKD của AV). Sự phối hợp hai thành

phần trên nhằm tạo ra các phức hợp hoặc hỗn hợp dược chất có độ tan và sinh khả

dụng phù hợp cho thiết kế dạng viên nén PTKD (NV hòa tan sớm để tạo liều khởi

đầu, AV hòa tan chậm hơn để duy trì và kéo dài nồng độ thuốc trong máu).

Trong thực tế, đã có dạng nguyên liệu phức hợp AV và NV theo tỷ lệ đồng mol

(1:1) tạo thành phân tử divalproex natri có dạng bột tinh thể rắn, thuận lợi để bào chế

dạng viên nén PTKD bằng các kỹ thuật đơn giản như dập thẳng hoặc xát hạt ướt. Tuy

nhiên, sản phẩm dạng này hiện chưa có trên thị trường Việt Nam (Depakote® ). Một



17

dạng khác của sự phối hợp hai thành phần kể trên theo tỷ lệ NV : AV (2:1) đã có sản

phẩm dạng viên PTKD lưu hành phổ biến trên thị trường Việt Nam (Depakine

Chrono 500), đây thực chất là dạng phối hợp 02 thành phần dược chất có dạng rắn

(NV) và lỏng (AV) để bào chế thành viên. Không giống phức hợp divalproex, dạng

phối hợp đòi hỏi kỹ thuật bào chế khá phức tạp do các tính chất đặc biệt của các

nguyên liệu (dạng lỏng của AV, tính chất háo ẩm mạnh của NV). Để bào chế được

sản phẩm dạng viên nén phối hợp này, cần nghiên cứu chuyển AV từ dạng lỏng thành

dạng rắn bằng cách sử dụng các loại tá dược hút phù hợp trước khi tạo hạt với các

thành phần khác và dập viên. Bên cạnh đó, cũng cần lưu ý đến việc kiểm soát độ ẩm

của môi trường sản xuất vì đây là sản phẩm có tính háo ẩm mạnh.

Với các cách tiếp cận khác nhau, dù đi từ nguyên liệu dạng phức hợp

(divalproex) hay dạng phối hợp, đã có nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến kỹ

thuật bào chế các chế phẩm chứa NV và AV dưới các dạng viên nén, viên nang

PTKD được thực hiện và công bố bởi nhiều nhóm tác giả, bao gồm :

Shah và cộng sự (1993) đã nghiên cứu sử dụng tá dược hút để xử lý chuyển

dạng AV từ lỏng sang thể rắn trước khi điều chế thành dạng viên nén. Nhóm tác giả

này đã chọn được các tá dược hút tạo thành khối ẩm không kết dính, phù hợp với

phương pháp dập thẳng. Bằng kỹ thuật này, các tác giả đã bào chế được các viên

nhân để bao đường và bao phim từ nguyên liệu AV dạng lỏng [93].

Khetarpal và cộng sự (2012) đã nghiên cứu bào chế viên nang chứa AV sau

khi sử dụng tá dược hút Aeroperl® 300 Pharma (colloidal silicon dioxid) để xử lý

chuyển dạng AV từ thể lỏng sang dạng bột rắn bằng cách phối trộn Aeroperl® 300

Pharma với AV theo tỷ lệ là 1:1,5 trước khi tạo hạt và đóng nang. Kết quả đánh giá

về độ trơn chảy, phổ cận hồng ngoại (FTIR), phổ phân tích nhiệt vi sai (DSC) đã

chứng tỏ hỗn hợp bột rắn tạo thành có độ trơn chảy tốt, không có tương kỵ hóa học

xảy ra giữa dược chất và tá dược. Bên cạnh đó, các phân tích định lượng bằng sắc

ký khí (GC) cũng đã cho thấy sản phẩm đạt được sự đồng nhất về hàm lượng, sản

phẩm hòa tan hoàn toàn sau 90 phút trong môi trường thử nghiệm, đạt độ ổn định



18

sau 3 tháng theo dõi trong điều kiện thực (nhiệt độ 25oC/độ ẩm tương đối 60%) và

điều kiện lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40oC/độ ẩm tương đối 75%) 67.

Phaechamud T. và cộng sự (2010) đã điều chế viên bao phim PTKD chứa hỗn

hợp NV và AV theo tỷ lệ 2 :1 (tương đương 500 mg NV) bằng kỹ thuật xát hạt ướt.

Các tác giả đã dùng tá dược hút là Carbosil ® 200 để chuyển AV từ dạng lỏng thành

dạng rắn trước khi tạo hạt với polyme HPMC K15M và các tá dược khác và dập

viên trong môi trường có độ ẩm tương đối không quá 50 %. Kết quả các tác giả đã

bào chế thành công viên nhân PTKD dạng khung, sau đó tiến hành bao phim chống

ẩm bằng Eudragit® L30 D – 55 và HPMC. Sản phẩm đã được chứng minh đạt

tương đương hòa tan in vitro với thuốc đối chiếu Depakine® Chrono 500 [87].

Vamsy Krishana. A và cộng sự (2011) đã điều chế thành công viên divalproex

natri phóng thích kéo dài bằng kỹ thuật dập thẳng, sử dụng các polyme tạo khung

matrix thân nước [111].

Chakraborty S. và cộng sự (2009) đã nghiên cứu bào chế viên divalproex natri

phóng thích kéo dài với khung matrix hỗn hợp gồm polyme thân nước và polyme sơ

nước. Kết quả đã bào chế thành công dạng viên PTKD cho khả năng phóng thích

kéo dài đến 24 giờ, đạt tương đương hòa tan in vitro với thuốc gốc Depakote® [39].

Giannola và cộng sự (1995) đã nghiên cứu thành công viên nang chứa vi hạt

PTKD của AV, dựa trên 2 chất tạo khung thân dầu căn bản là sáp ong [53] và sáp

carnauba [54]. Sản phẩm vi hạt với chất tạo khung là sáp ong có thể kéo dài tốc độ

phóng thích đến 14 giờ, và có động học phóng thích hoạt theo bậc 1. Đối với tá

dược sáp ong, nhóm tác giả đã dùng kỹ thuật đun nóng chảy để kết hợp dược chất

dạng lỏng (AV) tạo thành khung matrix sơ nước, sự phóng thích dược chất của AV

từ vi hạt tuân theo động học bậc 1 [53].

Lakhani KM. và các cộng sự (2012) đã nghiên cứu bào chế và đánh giá viên

bao phim PTKD chứa hoạt chất divalproex natri, sử dụng HPMC K 15M phối hợp

với Eudragit L100 để tạo khung kiểm soát sự GPHC, kết hợp với các tá dược độn

(MCC, lactose và povidon), tá dược trơn - bóng (talc, magnesi stearat và aerosil) để

nén viên bằng kỹ thuật dập thẳng. Viên nhân sau đó được bao phim với polyme



19

HPMC 615. Các tác giả đã sử dụng mô hình thiết kế đầy đủ 32 gồm 9 thí nghiệm

với 02 biến số độc lập là hàm lượng polyme HPMC K 15M và Eudragit L 100. Biến

số đầu ra lựa chọn là % hoạt chất giải phóng sau các thời điểm 3 giờ và 12 giờ. Kết

quả đã xác định được hàm lượng tối ưu của các polyme trong tạo khung kiểm soát

sự GPHC lần lượt là 15 % và 10 % so với khối lượng viên. Sản phẩm từ công thức

tối ưu có độ hòa tan đạt tương đương với sản phẩm thương mại trên thị trường, có

động học GPHC gần với mô hình bậc 1, đạt độ ổn định sau 1 tháng theo dõi trong

điều kiện lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40 + 2oC/độ ẩm tương đối 75 + 5%) 70.

Jeganath S., và cộng sự (2012) đã nghiên cứu bào chế thành công viên bao

PTKD của divalproex natri bằng kỹ thuật dập thẳng, sử dụng 2 polyme tạo khung

matrix là HPMC K100 M và HPMC K 4M với tỷ lệ lần lượt 4 % và 2,5 % so với

khối lượng viên, cùng các tá dược độn (Avicel pH 102, lactose, tinh bột, povidon)

và tá dược trơn (talc, magnesi stearat, Aerosil). Viên nhân được đem bao phim bằng

HPMC 615. Kết quả khung có thể giúp kiểm soát GPHC kéo dài trong 24 giờ và độ

hòa tan đạt tương đương so với sản phẩm thương mại trên thị trường. Ngoài ra, các

kết quả nghiên cứu cũng đã cho thấy sản phẩm đạt độ ổn định về chất lượng và khả

năng GPHC sau 3 tháng đánh giá trong điều kiện theo dõi thực (nhiệt độ 30oC/độ

ẩm tương đối 65%) và lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40oC/độ ẩm tương đối 75%) 61.

Worawan Saingam và cộng sự (2012) đã phát triển công thức viên nén nhiều

lớp PTKD của NV và AV trong 24 giờ. Các tác giả đã sử dụng HPMC K 15M,

dicalci photphat, talc và silicon dioxyd để tạo viên nén PTKD 3 lớp, lớp giữa chứa

hoạt chất (NV và AV) cùng với HPMC K 15M (tỷ lệ 2,5% so khối lượng viên),

dicanxi photphat, talc và silicon dioxyd, 2 lớp ngoài chứa HPMC K 15M (tỷ lệ 25%

so với khối lượng viên). Các tác giả đã sử dụng colloidal silicon dioxid để hút

thành phần lỏng AV sau đó phối hợp tạo hạt với các thành phần còn lại (HPMC

K15M, dicanxi photphat, talc). Viên 3 lớp được sản xuất bằng kỹ thuật dập nén. Độ

hòa tan được đánh giá bằng giỏ quay, các môi trường thử là 900 ml nước; dung dịch

0,1N HCl pH 1,2; dung dịch đệm phosphat 6,8 và dung dịch pH thay đổi (2 giờ đầu

sử dụng dung dịch HCl 0,1N và 22 giờ tiếp theo sử dụng đệm phosphat 6,8), nhiệt



20

độ thử là 37,5 °C. Thời gian lấy mẫu sau 15 phút, 30 phút, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 15, 18, 21, 24 giờ, mỗi lần lấy10 ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm và chạy

HPLC. Kết quả đánh giá độ hòa tan cho thấy khi pH tăng, độ hòa tan tăng, độ hòa

tan sau 24 giờ trong môi trường nước là 85,87 %, trong môi trường đệm phosphat

6,8 là 76,72%, trong môi trường pH thay đổi 69,03 %, trong môi trường acid HCl

0,1N pH 1,2 là 26,64 %. NV hòa tan tốt ở pH trung tính hơn AV, AV hòa tan tốt

hơn ở pH 7,4. Tóm lại, bằng cách sử dụng tá dược hút colloidal silicon dioxid để xử

lý AV và kỹ thuật dập nén, các tác giả đã bào chế thành công viên nén PTKD cấu

trúc 3 lớp chứa NV và AV cho sự GPHC kéo dài trong vòng 24 giờ 117.

1.3.4. Các nghiên cứu về định lượng AV và NV

1.3.4.1. Nghiên cứu định lượng AV, NV trong chế phẩm

AV trong các chế phẩm có thể được định lượng bằng các phương pháp như

sắc ký khí 39, hoặc sắc ký lỏng cao áp 98. Đối với NV trong các chế phẩm,

phương pháp định lượng chủ yếu là bằng HPLC 55, 101, 104.

Đối với các chế phẩm chứa phức hợp NV và AV tỷ lệ mol là 1:1 (divalproex

natri) hoặc dạng phối hợp theo tỷ lệ là 2 : 1. Phương pháp HPLC pha đảo, với các

hệ pha động khác nhau, phát hiện bằng đầu dò UV-vis hoặc dãy diod quang (PDA)

thường được sử dụng. Phaechamud và cộng sự đã sử dụng cột C18, pha động là

acetoniltril – đệm phosphat (60 : 40) điều chỉnh về pH 3.0, phát hiện bằng đầu dò

PDA ở bước sóng 220 nm để định lượng AV và NV trong viên PTKD 87. Theo IP

2010, divalproex trong viên được định lượng với hệ pha động là acetonitril – đệm

citrat (30 : 70) điều chỉnh về pH 3.0, bước sóng phát hiện ở 210 nm 103. Với USP

36, divalproex trong chế phẩm được định lượng với hệ pha động methanol – đệm

citrat (11: 9) điều chỉnh về pH 5.0, phát hiện ở bước sóng 210 nm 104.

1.3.4.2. Nghiên cứu định lượng AV trong dịch sinh học

AV trong dịch sinh học có thể được định lượng bằng các kỹ thuật như miễn

dịch enzyme 45, hoặc kỹ thuật điện di mao quản 51. Tuy nhiên các phương pháp

HPLC phát hiện bằng detector khối phổ (bảng 1.2), hoặc detector UV (bảng 1.3)

thường được chọn để định lượng AV và NV trong các mẫu dịch sinh học.



21

Bảng 1. 2. Các phương pháp LC-MS dùng định lượng AV trong dịch sinh học

Phương pháp



Điều kiện tiến hành



LLOQ



Cột Poroshell C18 (50 x 4,6 mm; 2,7 micron), tiền cột

SecurityGuard C18 (4 x 3,0 mm). Nhiệt độ cột 40oC

Pha động : Gradient với Nước : MeCN tỷ lệ (10 : 90)

LC-MS/MS,



trong 4 phút đầu, thay đổi (60 : 40) trong 0,5 phút sau.



chiết pha rắn



Tốc độ dòng : 0,9 ml/phút.



0,5g/ml

57



Thời gian lưu của AV : 4,46 phút

Detector : 1100 VL Quadrupole, chế độ MRM

Thể tích tiêm : 20 µl.

Cột Waters C18 (50 x 2,1mm; 5,0 micron). Nhiệt độ

LC-MS/MS,

kết tủa



cột 30oC

Pha động: MeCN : amoni acetat 20mM (70:30)



protein và



Tốc độ dòng : 0,8 ml/phút.



chiết lỏng -



Thời gian lưu của AV : 0,89 phút



lỏng.



1ng/ml

64



Detector : ACCQUITY TQD, chế độ MRM

Thể tích tiêm : 5,0 µl.

Cột C18 (100 x 3 mm; 3,5 micron). Nhiệt độ cột 45oC



LC-MS/MS,



Pha động: MeCN : acid acetic 0,1% (48:52)



kết tủa



Tốc độ dòng : 0,8 ml/phút.



protein.



Thời gian lưu của AV: 1,8 phút



5g/ml

72



Detector : 1100 VL Quadrupole, chế độ SIM

Thể tích tiêm : 2,0 µl.

Cột C18 (100 x 3mm; 3,5 micron). Nhiệt độ cột 45oC

Pha động: MeCN : acid acetic 0,1% (40:60)

LC-MS, kết



Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút.



tủa protein



Thời gian lưu của AV : 2,3 phút

Detector : G6410A –TQD, chế độ SIM

Thể tích tiêm : 2,0 µl.



2g/ml

100



22

Bảng 1. 3. Các phương pháp HPLC dùng định lượng AV trong dịch sinh học.

Phương



Điều kiện tiến hành



pháp



định lượng



HPLC pha



Cột CN (250 x 4,6 mm, 5 micron)



thuận, chiết



Pha động Acetonitril - đệm phosphat pH 3.5 (30:70)



pha rắn



Giới hạn



1,25 g/ml



Tốc độ dòng : 1ml/phút; Thể tích tiêm : 20µl



26



Detector : Phát hiện tại UV 210 nm

HPLC pha



Cột C18 (250 x 4,6mm, 5 micron). Nhiệt độ cột 50oC



đảo, chiết

pha rắn



Pha động Acetonitril - đệm phosphate, pH 3.0 (45:55)

Tốc độ dòng : 1,2ml/phút; Thể tích tiêm : 50 µl



1 g/ml



Thời gian lưu của AV : 7,1 phút

Detector : DAD từ 360 nm – 210 nm

HPLC pha



Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 micron). Nhiệt độ cột 48oC

Pha động : Acetonitril- đệm phosphat pH 3.5 (49:51)



đảo, kết tủa



Tốc độ dòng : 1,2 ml/phút; Thể tích tiêm : 20 µl



protein



68



10 g/ml



Thời gian lưu của AV : 9,7 phút

Detector : Phát hiện tại UV 220 nm



76



Nazeri Ali và cộng sự (2014) đã nghiên cứu 2 phương pháp định lượng AV

trong dịch sinh học là sắc ký khí (GC) và HPLC. Kết quả cho thấy phương pháp GC

có LLOQ thấp hơn (8g/ml), hệ số phân tán (CV %) của kết quả định lượng trong

ngày và khác ngày đều thấp hơn so với phương pháp HLPC. Ngoài ra, qui trình

phân tích mẫu cũng được rút ngắn (6 phút so với 17 phút của HPLC) 82.

1.3.5. Các nghiên cứu dược động học và hiệu quả trị liệu của AV và NV

Nghiên cứu so sánh giữa dạng phóng thích kéo dài so với viên bao tan trong

ruột đã chứng tỏ viên phóng thích kéo dài có sự dung nạp tốt hơn, hiệu quả kiểm

soát các cơn động kinh và cải thiện các triệu chứng tâm thần tốt hơn, được bệnh

nhân thích sử dụng hơn, ít gây ra các tác dụng phụ như rối loạn tiêu hóa, tăng cân,

cảm giác run rẩy khi dùng dạng thuốc phóng thích kéo dài [79].

Akira F. và cộng sự (2008) đã tiến hành một nghiên cứu so sánh tương đương

sinh học in vivo và hòa tan in vitro của 2 chế phẩm PTKD của AV trên thị trường



23

(Depakene R và Selenica R). Nghiên cứu tương đương sinh học được thực hiện

trên 12 Người tình nguyện tại Nhật Bản, dùng liều đơn 600 mg AV, lấy mẫu máu

đến 72 giờ và định lượng AV trong huyết tương bằng phương pháp miễn dịch

enzym. Thử nghiệm độ hòa tan in vitro được tiến hành trong môi trường đệm

phosphat pH 6,8 trên thiết bị cánh khuấy, tốc độ 50 vòng phút và định lượng hoạt

chất hòa tan bằng phương pháp HPLC. Kết quả nghiên cứu về độ hòa tan in vitro

cho thấy Depakene R có tốc độ hòa tan nhanh hơn so với Selenica R, tương ứng kết

quả trong nghiên cứu in vivo cho thấy thuốc này cũng đạt nồng độ đỉnh trong máu

sớm hơn so với Selenica R (Tmax của Depakene R là 10,8 + 1,6 phút so với 17,6 + 1,7

phút của Selenica R). Tuy nhiên Cmax và AUC của 2 thuốc khác nhau không có ý

nghĩa thống kê ( p < 0,05). Như vậy, với dạng PTKD chứa AV, tốc độ hòa tan trong

in vitro có thể làm tăng tốc độ hấp thu thuốc trong điều kiện in vivo, làm cho thuốc

được hấp thu nhanh hơn. Tuy nhiên, tổng mức hấp thu là không đổi, đồng nghĩa với

khả dụng sinh học của thuốc không bị ảnh hưởng 23.

Một nghiên cứu khác được thực hiện bởi tác giả Lance P. Longo và cộng sự

(2005) về đánh giá hiệu quả sử dụng của viên divalproex natri PTKD cho các bệnh

nhân rối loạn cảm xúc lưỡng cực thể I và II gặp các tác dụng không mong muốn khi

dùng viên divalproex natri bao tan trong ruột. Kết quả cho thấy viên PTKD có sự

dung nạp tốt hơn, an toàn và hiệu quả kéo dài, giảm được các tác dụng không mong

muốn một cách rõ rệt (so với dùng viên bao tan trong ruột). Sự hài lòng và tỷ lệ

tuân thủ tốt liệu trình điều trị của bệnh nhân tăng lên đáng kể [71].

Nghiên cứu xác định tỉ lệ gắn protein huyết tương của acid valproic đã được

Patricia W. và cộng sự (1996) thực hiện trên động vật thử nghiệm. Kết quả cho

thấy tỉ lệ gắn kết của AV với huyết tương giảm từ 91 % xuống còn 42 % khi nồng

độ acid valproic trong huyết tương tăng từ 10 µm/ml - 100 µg/ml [84].

Các nghiên cứu về dược động học của AV cũng đã được thực hiện bởi

Andrew A. và cộng sự (1984) bằng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ. Các tác giả

đã xác định được nồng độ AV trong dịch não tủy có thể đạt đến khoảng nồng độ

28,2 µg/ml sau khi sử dụng liều thông thường [27].



24

Nghiên cứu so sánh sinh khả dụng của dạng viên phóng thích kéo dài

divalproex (divalproex ER) và dạng bao tan trong ruột (divalproex DR). Kết quả

cho thấy dạng divalproex - ER với liều uống 1 lần trong ngày dù có nồng độ thuốc

trong máu thấp hơn divalproex - DR trung bình từ 8 – 20 % tại thời điểm sau 2 - 4

giờ, nhưng nồng độ thuốc ổn định hơn trong máu và kéo dài đến 24 giờ. Hiệu lực và



Nồng độ VA trong huyết tương (mg/l)



tính an toàn như nhau khi so với dạng divalproex - DR dùng 3 lần/ngày (Hình 1.4).



Liều divalproex DR

hoặc divalproex ER

ER



Liều divalproex DR



Liều divalproex DR



Hình 1.4. Nồng độ thuốc trong máu của divalproex ER và DR theo thời gian [110].

1.4. ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

1.4.1. Phân tích hoạt chất trong dịch sinh học [47], [108]

Mẫu sinh học

Dịch sinh học trong cơ thể gồm máu (huyết thanh, huyết tương), nước tiểu,

dịch não tủy, dịch màng phổi, chất chứa trong dạ dày, dịch màng ối,…

Huyết tương là phần lỏng của máu, màu vàng nhạt, pH hơi kiềm. Thành phần

của huyết tương gồm có muối, nước, và các chất hữu cơ như protid, glucid, lipid, các

phân hóa tố, sinh tố, hormon, các kháng thể và các yếu tố đông máu.

Phương pháp xử lý mẫu

Mẫu sinh học cần phải được xử lý trước khi tiến hành phân tích, nhằm mục

đích chiết tách được tối đa lượng hoạt chất và loại bỏ hoàn toàn protein có trong

huyết tương. Bên cạnh đó, thông thường nồng độ các hoạt chất trong các mẫu sinh

học là rất nhỏ, lẫn protein và các tạp chất khác, có thể bám dính lên bề mặt chất

mang của cột sắc ký, gây nguy cơ làm tắc cột. Có nhiều phương pháp xử lý mẫu khác



25

nhau có thể áp dụng như: phương pháp kết tủa protein, phương pháp chiết lỏng - lỏng,

phương pháp chiết pha rắn, phương pháp chiết lỏng - lỏng trên nền rắn, hoặc kết hợp

nhiều phương pháp đồng thời để tăng hiệu quả chiết tách mẫu.

1.4.2. Thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất trong dịch sinh học [47],

[108]

1.4.2.1. Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu của phương pháp là khả năng cho phép xác định một cách

chính xác sự hiện diện của các thành phần trong mẫu phân tích. Cần chứng minh

chất xác định được là dược chất hay chất chuyển hoá cần phân tích và quá trình

phân tích không bị ảnh hưởng bởi các chất nội sinh hoặc chất chuyển hoá liên quan.

1.4.2.2. Ảnh hưởng của nền mẫu

Giá trị hệ số nền mẫu (MF) của AV và nội chuẩn (IS) được xác định bằng

cách so sánh diện tích pic của AV và IS của các mẫu pha trong nền mẫu so với diện

tích pic của các mẫu pha trong pha động. Một phương pháp được coi là không bị

ảnh hưởng bởi nền mẫu khi giá trị CV của tỷ số MFAV/MFIS trên ít nhất 6 nền mẫu

trắng có nguồn gốc khác nhau phải không vượt quá 15 %.

1.4.2.3. Độ nhiễm chéo

Mẫu được coi là không bị nhiễm chéo trong quá trình tiêm mẫu khi tiêm mẫu trắng

sau mẫu có nồng độ cao nhất của đường chuẩn thì đáp ứng pic của mẫu trắng so với mẫu

chuẩn tại thời gian lưu của AV phải không vượt quá 20 %, tại thời gian lưu của IS không

vượt quá 5% so với đáp ứng của mẫu ở nồng độ định lượng dưới (LLOQ).

1.4.2.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày

Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên giá trị nồng độ định lượng dưới

(LLOQ) và 3 mức nồng độ khác nhau trong khoảng nồng độ dự định đo, mỗi nồng

độ tiến hành ít nhất 5 mẫu. Độ đúng trong ngày và khác ngày phải đạt trong khoảng

85 % - 115 %; độ chính xác trong ngày và khác ngày với CV %  15 %. Riêng với

nồng độ LLOQ, cho phép độ đúng trong khoảng 80 % - 120 % và CV %  20 %.

1.4.2.5. Độ phục hồi (hiệu suất chiết)

Hiệu suất chiết là khả năng thu hồi chất cần phân tích khi áp dụng một kỹ



26

thuật xử lý mẫu trong phương pháp phân tích. Hiệu suất chiết được tính bằng tỷ lệ

(%) chất cần phân tích xác định được trong các mẫu qua chiết tách so với lượng xác

định được khi phân tích các mẫu không qua chiết tách (pha trong dung môi).

Hiệu suất chiết được xác định trên 3 mức nồng độ (thấp, trung bình và cao)

với ít nhất 5 mẫu ở mỗi nồng độ. Phương pháp xử lý mẫu không nhất thiết phải có

hiệu suất chiết đạt mức 100 % nhưng phải có độ lặp lại tốt, với hiệu suất chiết trung

bình giữa các nồng độ khác nhau không quá + 15 %. Không nên sử dụng các

phương pháp phân tích có hiệu suất chiết thấp hơn 30 % hoặc cao hơn 110 %.

1.4.2.6. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn phải bao gồm số điểm chuẩn đủ để xác định mối quan hệ giữa

nồng độ và đáp ứng thiết bị, thông thường bao gồm 6 - 8 điểm bao trùm khoảng

nồng độ của mẫu thử dự định phân tích. Khoảng nồng độ của đường chuẩn/khoảng

tuyến tính được xác định dựa vào giá trị Cmax đã ghi trong tài liệu tham khảo hoặc

kinh nghiệm từ những nghiên cứu trước đó và phải đạt từ 1/30 - 1/10 Cmax đến 2 - 3

Cmax. Mối quan hệ giữa đáp ứng với nồng độ phải được đánh giá bằng mô hình đơn

giản nhất với khoảng tuyến tính xác định bằng phương pháp bình phương nhỏ nhất.

1.4.2.7. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

LLOQ là giá trị nồng độ thấp nhất của đường chuẩn có thể xác định được với

độ đúng và độ chính xác cho phép. LLOQ thể hiện độ nhạy của phương pháp.

1.4.2.8. Nghiên cứu độ ổn định hoạt chất và thuốc thử trong mẫu sinh học

Độ ổn định trong dung dịch chuẩn gốc/chuẩn làm việc

Độ ổn định của các dung dịch chuẩn gốc/chuẩn làm việc được đánh giá ở nhiệt

độ phòng ít nhất là 4 giờ đủ để thực hiện các thao tác pha mẫu. Nếu dự định bảo

quản các dung dịch chuẩn gốc đông lạnh để dùng dài ngày, cần khảo sát đưa ra dữ

liệu ổn định trong điều kiện và thời gian bảo quản thích hợp. Cần đủ dữ liệu đánh

giá trên ít nhất 3 mẫu độc lập ở nồng độ thích hợp. Dung dịch được coi là ổn định

khi giá trị nồng độ của mẫu ổn định sai khác so với nồng độ ban đầu không quá 2,0

% với phương pháp HPLC và GC, không quá 5,0 % với phương pháp LC/MS.