Tiến hành thẩm định qui trình HPLC định lượng hoạt chất trong chế phẩm theo hướng dẫn của ICH, thực hiện trên mẫu sản phẩm thử

35

kiện 6 mẫu dung dịch chuẩn có cùng nồng độ. Đánh giá độ lặp lại của diện tích pic

và thời gian lưu dựa trên giá trị hệ số phân tán (CV %).

Tính đặc hiệu

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và mẫu thử có cùng nồng độ xấp xỉ 2 mg/ml

natri valproat trong nước (được chuẩn bị giống như mục 2.2.1.1).

Dung dịch mẫu placebo: Cân một lượng bột placebo tương ứng của 1/5 viên

(tương ứng khoảng 55,2 mg placebo) cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 5

ml methanol, lắc mạnh cho tới khi polyme trương nở hoàn toàn, siêu âm 2 phút,

thêm vừa nước cất đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc sartorius RC 0,45 µm.

Tiến hành sắc ký các mẫu placebo, chuẩn, thử và dung môi pha động. Đánh

giá tính đặc hiệu của phương pháp dựa trên pic của mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu

placebo, dung môi pha động và độ tinh khiết của pic dựa trên so sánh phổ UV tại

các điểm khác nhau trên pic.

Tính tuyến tính

Tiến hành khảo sát trong khoảng nồng độ từ 1,19 - 2,76 mg/ml (tương đương

60 – 140 % so với nồng độ dung dịch chuẩn là 2 mg/ml natri valproat). Sắc ký các

mẫu chuẩn trên theo điều kiện sắc ký đã chọn, mỗi nồng độ phân tích 1 lần.

Lập phương trình hồi quy có dạng y = ax + b xác định mối tương quan giữa

nồng độ hoạt chất với diện tích pic. Kiểm tra hệ số a, b và tính tương thích của

phương trình hồi quy bằng thống kê.

Độ chính xác

Tiến hành trên 6 mẫu thử cùng nồng độ để xác định RSD % so với yêu cầu.

Độ chính xác trung gian

Hai kiểm nghiệm viên tiến hành phân tích các mẫu tự tạo có nồng độ xấp xỉ

natri valproat là 2 mg/ml trên hai hệ thống HPLC khác nhau trong hai ngày khác

nhau. Mỗi kiểm nghiệm viên thực hiện trên 6 mẫu. Xác định độ lặp lại khác ngày

dựa trên CV % và so sánh kết quả trung bình định lượng của 2 kiểm nghiệm viên.

Độ đúng

Chuẩn bị các mẫu giả định có nồng đô ̣ bằ ng 80 %, 100 % và 120 % so với



36

nồng độ dung dịch chuẩn, có thành phần theo bảng 2.8, mỗi hàm lươ ̣ng làm 3 mẫu.

Định lượng natri valproat trong các mẫu bằng phương pháp HPLC với các

điều kiện sắc ký đã chọn và tính toán tỷ lệ phục hồi so với giới hạn yêu cầu.

Bảng 2. 8. Mẫu thử nghiệm độ đúng

Thành phần



Mẫu độ đúng 80% Mẫu độ đúng 100% Mẫu độ đúng 120%



Acid valproic



23,2 mg



29,0 mg



34,8 mg



Natri valproat



53,3 mg



66,6 mg



79,9 mg



79,94 mg



99,93 mg



119,91 mg



55,2 mg



55,2 mg



55,2 mg



(Tương ứng natri

valproat qui đổi)

Placebo



Tất cả các thành phần trên được cân và cho vào bình định mức 50 ml, thêm

khoảng 5 ml methanol, lắc mạnh, siêu âm 2 phút, thêm nước cất vừa đủ đến vạch,

lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

2.2.1.2. Khảo sát độ hòa tan viên đối chiếu và xây dựng chỉ tiêu độ hòa tan cho

chế phẩm.

Thử nghiệm tiến hành trên mẫu viên đối chiếu Depakine Chrono 500 mg (số

lô: 1A662, NSX: 11/2012, HD: 10/2015, SĐK: VN - 4095 - 07).

Khảo sát xây dựng phương pháp thử độ hòa tan và định lượng hoạt chất

Môi trường thử độ hòa tan được chọn dựa trên tham khảo từ chuyên luận viên

phóng thích kéo dài divalproex natri trong USP 36 104. Với thời gian khảo sát là

45 phút trong môi trường HCl 0,1N và từ 1- 12 giờ trong môi trường đệm pH 5,5.

Môi trường acid:

- Điều kiện thí nghiệm:

Thiết bị: Kiểu cánh khuấ y;

Môi trường: 500 ml dung dịch hydrocloric 0,1N (TT) (không sử dụng NaCl);

Tốc độ: 100 vòng /phút;

Thời gian: 45 phút.

- Điều kiện sắc ký: Giống đinh

̣ lươ ̣ng hoạt chất trong chế phẩm (mục 2.2.1.1).

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 250 mg natri valproat chuẩn cho



37

vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 5 ml acetonitril, lắc mạnh, thêm methanol

vừa đủ đến vạch, siêu âm 2 phút, lắc đều. Hút chính xác 2 ml dung dịch trên cho

vào bình định mức 100 ml, thêm HCl 0,1M vừa đủ, lắc đều. Lọc qua màng lọc

sartorius RC 0,45 µm.

- Dung dịch thử: thử trên 6 viên, mỗi viên cho vào một cốc thử nghiệm. Sau

thời gian hòa tan lấ y dich

̣ trong mỗi cố c và lo ̣c qua màng lo ̣c 0,45 µm.

Tiến hành tiêm lần lượt 100 µl các dung dịch chuẩn và thử.

Độ hòa tan của NV trong môi trường acid được tính theo công thức sau:

ĐHT 1 (%) =

Trong đó:



ST  500  mC

 C 100

SC  dflC  0,5



(2.2)



ST: diện tích pic của dung dịch thử (mAU*phút);

SC: diện tích pic của dung dịch chuẩn (mAU*phút);

dflC: độ pha loãng của dung dịch chuẩn;

mC : khối lượng cân chuẩn (g);

C: hàm lượng chất chuẩn.

Môi trường đệm pH 5,5

Điều kiện thí nghiệm:

- Thiết bị: Kiểu cánh khuấ y.

- Môi trường thử : 900 ml dung dịch đệm phosphat pH 5,5 được chuẩn bị như

sau: Sau khi thử đô ̣ hòa tan trong môi trường acid, lấy cốc ra khỏi máy thử độ hòa

tan, gạn bỏ từ từ dịch acid ra khỏi cốc. Sau đó, rót từ từ 900 ml dung dịch đệm pH

phosphat pH 5,5 đã được làm nóng 37oC  0,5 vào theo thành cốc, sau đó nhẹ

nhàng lắp cốc vào lại máy thử độ hòa tan.

- Cách pha dung dịch đệm phosphat pH 5,5: Hòa tan 6,9 g NaH2PO4, 0,12 g

NaOH và 5 g natri lauryl sulphat trong 1000 ml nước cất (chỉnh về pH 5,5 bằng

NaOH 1N hoặc H3PO4 10 %).

- Tốc độ cánh khuấy: 100 vòng / phút.

Thời gian đánh giá: Sau 2, 6, 12 giờ, mỗi thời điểm hút khoảng 10 ml dịch hòa



38

tan, lọc qua màng lọc sartorius RC 0,45 μm (không bù dịch). Tiến hành định lượng

hoạt chất để thiết lập các mốc giới hạn hòa tan của sản phẩm.

Ngoài ra, để khảo sát động học GPHC, các điểm lấy mẫu đo độ hòa tan của

viên đối chiếu được khảo sát thêm là 1, 4, 8 và 10 giờ.

Điều kiện sắc ký: Giống định lượng hoạt chất trong chế phẩm (mục 2.2.1.1).

Dung dịch thử: Sau từng thời điểm khảo sát (1, 2, 4, 6, 8, 10 và 12 giờ), hút

lấy dung dịch hòa tan (không bù dịch). Lọc qua màng lọc sartorius RC 0,45 µm.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 55,6 mg natri valproat chuẩn cho vào

bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml đệm pH 5,5. Lắc mạnh, siêu âm 5 phút

để hòa tan, thêm dung dịch đệm phosphat pH 5,5 vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua

màng lọc 0,45 µm. Tiến hành tiêm lần lượt 100 µl các dung dịch chuẩn và thử.

Độ hòa tan của chế phẩm (theo natri valproat) trong môi trường đệm pH 5,5

được tính theo các công thức sau:

Công thức tính hàm lượng phần trăm theo từng thời điểm :

HLi (%) 



ST  dflT  mC

 C 100

SC  dflC  0,5



(2.3)



Trong đó:

ST: diện tích pic của dung dịch thử (mAU*phút);

SC: diện tích pic của dung dịch chuẩn (mAU*phút);

dflT: độ pha loãng của dung dịch thử;

dflC: độ pha loãng của dung dịch chuẩn;

mC : khối lượng cân chuẩn (g);

C: hàm lượng chất chuẩn.

Công thức tính lượng mẫu được hút ra tại mỗi thời điểm :

HRi (%) 



HLi

 10

Vi



Trong đó:

HRi: Lượng mẫu hút ra tại thời điểm i (%);

HLi: Hàm lượng phần trăm tại thời điểm i (%);



(2.4)



39

Vi: Thể tích môi trường hòa tan còn lại tại thời điểm i (ml);

10: Thể tích mẫu được hút ra (ml).

Công thức tính độ hòa tan tại mỗi thời đểm :

TLi (%)  HLi  1 HRi 1

i



(2.5)



Trong đó:

TLi: Độ hòa tan tại thời điểm i (%);

HLi: Hàm lượng phần trăm tại thời điểm i (%);

HRi-1: Lượng mẫu được hút ra tại thời điểm i - 1(%).

Thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất trong môi trường hòa tan

Tiến hành thẩm định qui trình HPLC định lượng hoạt chất hòa tan trong chế

phẩm theo các hướng dẫn chung của ICH.

Xây dựng chỉ tiêu độ hòa tan cho chế phẩm

Trên cơ sở độ hòa tan của viên đối chiếu, kết hợp tham khảo tài liệu qui định

chung về tiêu chuẩn độ hòa tan của thuốc PTKD [62], dự kiến chỉ tiêu độ hòa tan

cho chế phẩm. Ngoài ra, xác định mô hình động học GPHC của viên đối chiếu để

dự đoán cấu trúc chế phẩm, làm cơ sở định hướng thiết kế cho sản phẩm của đề tài.

2.2.1.3. Xây dựng công thức bào chế viên nhân

Trên cơ sở mô hình động học GPHC của viên đối chiếu đã được xác định, cấu

trúc dự kiến cho viên nhân sẽ là dạng khung và được thực hiện theo phương pháp

xát hạt ướt. Trong đó, nghiên cứu khảo sát lựa chọn các loại tá dược tạo khung phù

hợp và các tá dược khác để thiết kế công thức viên nhân cho chế phẩm.

a. Khảo sát polyme tạo khung kiểm soát sự GPHC

Khảo sát polyme tạo khung với HPMC K 15M với các tỷ lệ cơ bản 10 %, 15

% và 20%. Khảo sát phối hợp HPMC K 15M với polyme độ nhớt thấp HPMC 615

với tỷ lệ cơ bản 2,5 %, 5,0 % để cải thiện khả năng kiểm soát sự GPHC của khung.

Bào chế viên nhân và lấy mẫu đo độ GPHC. Xác định tỷ lệ cơ bản của các polyme.

b. Xây dựng công thức bào chế cơ bản

Công thức cơ bản được xây dựng dựa trên các cơ sở về các tính chất lý hóa

của các dược chất, kết quả khảo sát lựa chọn polyme tạo khung trong các thử



40

nghiệm thăm dò, các kết quả khảo sát độ hòa tan và động học GPHC từ thuốc đối

chiếu. Công thức bào chế cơ bản với các thành phần được trình bày trong bảng 2.9.

Bảng 2. 9. Thành phần công thức cơ bản.

Thành phần



Thành phần cho 1 viên (%)



Acid valproic



20,71



Natri valproat



47,57



HPMC K15M



X1



HPMC 615

PVP K30

Silicon dioxyd (Aerosil)



X2

2,14

5,71



Talc

Magnesi stearat

Dicalci phosphat dihydrat (Califarm D) vừa đủ



1

1,5

100



Bố trí thí nghiệm theo mô hình bậc 1, hai biến độc lập được khảo sát ở 2 mức.

c. Xây dựng phương trình bậc 1 biểu thị mối liên quan giữa các biến số

Thiết kế mô hình thí nghiệm theo phương pháp bậc 1 để xác lập mối liên quan

giữa các biến số độc lập xi (x1 là hàm lượng HPMC K15M; x2 là hàm lượng HPMC

615) với biến số đầu ra y (biến phụ thuộc) là độ hòa tan tại thời điểm 8 giờ.

Sở dĩ chọn độ hòa tan thời điểm 8 giờ làm biến đầu ra bởi vì quá trình GPHC

của khung ở các giờ gần cuối (từ 8 - 12 giờ) có xu hướng chậm dần do sự trương nở

gần như hoàn toàn và tạo màng gel bền vững kiểm soát sự GPHC của polyme. Do

vậy, độ hòa tan tại điểm 8 giờ có ý nghĩa quan trọng đối với sự GPHC ở giai đoạn

cuối của chế phẩm. Để có khả năng đạt tương đương hòa tan cao so với thuốc đối

chiếu, độ hòa tan tại điểm 8 giờ của sản phẩm nghiên cứu phải đạt xấp xỉ với giá trị

tương ứng của viên đối chiếu (độ hòa tan trung bình của viên đối chiếu tại thời điểm

8 giờ là 66,3 %). Vì vậy, khoảng giá trị mong muốn của y là 66,3 + 2 %.

Tiến hành bào chế cùng cỡ lô 2000 viên, với cùng quy trình bào chế giống

nhau. Trong đó, khoảng khảo sát của x1 thay đổi từ 12,2 % - 17,8 % và x2 từ 1,50 %

- 3,57 %. Lấy mẫu viên đánh giá độ hòa tan để xác lập mối liên quan giữa các biến

số độc lập (xi) với biến đầu ra (y) bằng phương trình bậc 1 theo công thức (2.6) :