Trong phần nghiên cứu xây dựng công thức bào chế, các số liệu thực nghiệm được tính toán và xử lý dựa trên các bảng công thức tính tự thiết lập trong Excel; trong xác định mô hình động học hòa tan, đồ thị động học GPHC và phương trình hồi quy theo mô...

55

C0 : số ngày kể từ ngày sản xuất đến ngày đưa vào tủ lão hóa;

K : hệ số Van’t Hoff = 2t/10, với t = t2 – t1

(trong trường hợp t2 = 40oC, t1 = 30oC thì t = 10, hệ số K = 2) 5.

C* = tuổi thọ ở nhiệt độ lão hóa cấp tốc = t90 (t2) = 0,1053/k1

2,303

Với k1 : hằng số tốc độ phân hủy bậc 1 theo thời gian =

x log (a/a-x)

t

a : hàm lượng (%) thuốc tại thời điểm ban đầu.

x : hàm lượng (%) thuốc bị phân hủy trong mẫu tại thời điểm t

Trường hợp khi có sự thay đổi hàm lượng vượt quá 5,0 % so với thời điểm

ban đầu thì không dùng dữ liệu độ ổn định trong điều kiện lão hóa cấp tốc để dự

đoán tuổi thọ sản phẩm 31.

2.2.2. Nghiên cứu tương đương sinh học in vivo

2.2.2.1. Phương pháp định lượng acid valproic trong huyết tương.

Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) được khảo sát và xây

dựng tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương.

a. Phương pháp chuẩn bị mẫu và xử lý mẫu huyết tương

Mẫu xây dựng đường chuẩn (CC) và giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Hòa tan chất chuẩn AV trong methanol để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ

AV chính xác khoảng 2000 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch chuẩn

làm việc WSS - CC1 và WSS - CC2 trong huyết tương có nồng độ chính xác khoảng

100 µg/ml và 10 µg/ml. Từ các dung dịch chuẩn làm việc WSS - CC1 và WSS - CC2,

pha các mẫu huyết tương trắng chứa chuẩn AV với nồng độ từ 1- 100 µg/ml.

Hòa tan chất chuẩn nội methylparaben (IS) trong methanol để thu được dung

dịch chuẩn nội gốc có nồng độ chính xác khoảng 500 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn

nội gốc, chuẩn bị dung dịch chuẩn nội làm việc trong nước có nồng độ

methylparaben chính xác khoảng 50 µg/ml.

Bảng 2. 14. Chuẩn bị mẫu xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Mẫu

LLOQ



Nồng độ (µg/ml )

1,0



V huyết tương trắng (µl)

450



V WSS-CC2 (µl)

50



56

Đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng, 01 mẫu huyết tương trắng có

chuẩn nội (zero) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn AV nồng độ từ 1- 100 µg/ml.

Chuẩn bị mẫu kiểm tra độ thích hợp của hệ thống (SST) và mẫu kiểm tra (QC)

Hòa tan chất chuẩn AV trong methanol để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng

độ AV chính xác khoảng 2000 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch

chuẩn làm việc WSS - QC1 và WSS - QC2 trong huyết tương có nồng độ chính xác

khoảng 100 µg/ml và 10 µg/ml. Chuẩn bị các dung dịch kiểm tra có nồng độ thấp

(LQC), nồng độ trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC) theo bảng 2.15.

Bảng 2. 15. Chuẩn bị mẫu kiểm tra trong huyết tương.

Mẫu



Nồng độ (µg/ml )



VWSS-QC1 (µl)



VWSS-QC2 (µl)



Vhuyết tương trắng (µl)



LQC



3



-



150



350



MQC



50



250



-



250



HQC



80



400



-



100



Mẫu kiểm tra độ thích hợp hệ thống được chuẩn bị hàng ngày (mẫu MQC, pha

theo bảng 2.15) và phân tích để kiểm tra độ thích hợp của hệ thống.

Mẫu khảo sát độ đúng - độ chính xác của phương pháp khi pha loãng

Hòa tan chuẩn AV trong methanol để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng

độ chính xác khoảng 2000 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc này, chuẩn bị dung dịch

chuẩn làm việc trong huyết tương có nồng độ AV chính xác khoảng 200 µg/ml.

Chuẩn bị các mẫu khảo sát độ đúng, độ chính xác khi pha loãng (AC) có nồng độ

lần lượt 6 µg/ml, 100 µg/ml và 160 µg/ml.

Phương pháp xử lý các mẫu huyết tương chứa acid valproic

Chuẩn bị mẫu: Các mẫu huyết tương (HT) tự tạo chứa AV được chuẩn bị

bằng cách hòa tan chuẩn AV vào các mẫu huyết tương trắng với các nồng độ khác

nhau. Mẫu được cấp đông trong tủ lạnh âm sâu ở nhiệt độ -35 + 50C.

Phương pháp xử lý mẫu: Các mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng.

Lấy 0,5 ml huyết tương, thêm 50 l dung dịch chuẩn nội (IS), lắc xoáy 5 giây. Thêm

2 ml acetonitril, lắc xoáy 15 giây, ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút. Hút dung

dịch lớp trên, tiêm sắc ký.



57

b.Thiết bị và điều kiện phân tích

Tiến hành phân tích trên máy sắc ký lỏng khối phổ siêu hiệu năng UHPLC –

MS/MS Waters đã được hiệu chuẩn theo qui định của ISO/IEC và GLP với các điều

kiện sắc ký và khối phổ như sau:

Điều kiện sắc ký

- Cột Phenomenex C18; 100 x 2,1 mm; 1,7 µm. Nhiê ̣t đô ̣ cô ̣t 400C.

- Pha động: Acetonitril : Acid acetic 0,1% (80 : 20).

- Tốc độ dòng:



0,2 ml/phút.



- Detector:



Xevo-TQD.



- Thể tích tiêm:



0,5 µl.



- Nhiệt độ autosampler: 200C.

Điều kiện khối phổ

Các thông số của thiết bị khối phổ được trình bày trong bảng 2.16.

Bảng 2. 16. Điều kiện sắc ký khối phổ dùng định lượng mẫu trong huyết tương

Hoạt chất

Thông số



acid valproic



methylparaben



Điện thế mao quản (kV)



3,5



3,5



Điện thế bộ phận chóp nón (V)



32



34



Nhiệt độ hóa hơi dòng pha động (oC)



400



400



Tốc độ thổi khí hóa hơi dòng pha động(L/H)



800



800



Tốc độ thổi khí qua bộ phận chóp nón (L/H)



20



20



Thế phân mãnh ion (V)



14



18



Ion ban đầu (Dalton)



m/z = 143,0



m/z = 150,97



Ion tạo thành (Dalton)



m/z = 143,0



m/z = 91,95



c. Thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất trong huyết tương

Thẩm định độ đặc hiệu, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, tỷ lệ

thu hồi hoạt chất, độ ổn định,...của phương pháp theo các hướng dẫn thẩm định

phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học của EMA 47 và FDA 108.



58

Tính tương thích hệ thống

Sắc ký lặp lại 6 lần mẫu SST, ghi lại sắc ký đồ đáp ứng pic của 6 lần phân tích

với các yêu cầu sau: pic của AV và IS cân đối; có sự lặp lại về thời gian lưu của AV

và IS với CV ≤ 2,0 %; Có sự lặp lại về diện tích pic của AV và IS với CV ≤ 5,0 %

Tính đặc hiệu – chọn lọc

Tiến hành phân tích sắc ký với các mẫu:

Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau.

Huyết tương trắng có pha chuẩn AV ở nồng độ LLOQ và IS (5,0 µg/ml)

Phương pháp được coi là có tính chọn lọc với AV và IS khi: pic của AV và IS

phải được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu; tại thời

điểm trùng với thời gian lưu của AV, tỷ lệ % đáp ứng pic trung bình của mẫu trắng so

với mẫu chuẩn ở nồng độ LLOQ không vượt quá 20 %.

Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, tỷ lệ % đáp ứng pic trung bình của

mẫu trắng so với mẫu chuẩn ở nồng độ LLOQ không vượt quá 5 %.

Ảnh hưởng của nền mẫu

Chuẩn bị 6 lô huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau, tiến hành xử lý theo qui

trình thu được dung dịch nền mẫu.

Chuẩn bị các mẫu chuẩn ở nồng độ thấp (LQC) và nồng độ cao (HQC) trong các

dung dịch nền mẫu tương ứng. Song song chuẩn bị các mẫu chuẩn LQC, HQC pha

trong pha động. Phân tích sắc ký các mẫu trên. Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic.

Giá trị hệ số nền mẫu (MF) của AV và IS được xác định bằng cách so sánh diện

tích pic của AV, IS các mẫu pha trong nền mẫu so với diện tích pic của các mẫu pha

trong pha động. Xác định tỷ số hệ số nền mẫu của AV và IS (MFAV/ MFIS).

Yêu cầu: Độ lặp lại về tỷ số MFAV / MFIS có CV(%) ≤ 15 %.

Độ nhiễm chéo

Chuẩn bị và xử lý các mẫu sau theo quy trình gồm : 06 mẫu huyết tương trắng;

06 mẫu chuẩn pha trong huyết tương ở nồng độ LLOQ; 06 mẫu chuẩn pha trong huyết

tương ở nồng độ ULOQ.

Tiêm sắc ký 06 mẫu LLOQ và tiêm xen kẽ mẫu trắng sau mẫu ULOQ. Ghi lại



59

sắc ký đồ và đáp ứng pic.

Yêu cầu: tại thời điểm trùng với thời gian lưu của AV, tỷ lệ % đáp ứng trung bình

của mẫu trắng so với mẫu chuẩn ở nồng độ LLOQ không vượt quá 20 %; tại thời điểm

trùng với thời gian lưu của IS, tỷ lệ % đáp ứng trung bình của mẫu trắng so với mẫu

chuẩn ở nồng độ LLOQ không vượt quá 5 %.

Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Để thiết lập mối tương quan giữa nồng độ của chất chuẩn với đáp ứng của thiết bị

phân tích, số lượng điểm chuẩn phải đủ lớn (gồm một mẫu trắng - blank, một mẫu

trắng có chuẩn nội - zero và ít nhất 6 mẫu chuẩn) và khoảng nồng độ khảo sát phải bao

hàm được khoảng nồng độ có thể đạt được trong quá trình phân tích mẫu (từ 1/30 1/10 đến 2 lần giá trị của Cmax). Khảo sát trên ít nhất 5 đường chuẩn để xác định hệ số

trọng số (weighting) phù hợp (1, 1/x, 1/x2 hoặc 1/x1/2)

Hệ số trọng số (weighting) được xác định theo phương pháp sau 25

Tiến hành trên ít nhất 5 đường chuẩn, mỗi đường chuẩn bao gồm ít nhất 6 nồng

độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học. Chuẩn bị các mẫu tự tạo

(TT) theo quy trình.

- Phân tích các mẫu TT theo phương pháp cần đánh giá.

- Xác định hệ số để phản ánh tốt nhất tương quan giữa đáp ứng píc và nồng độ:

Bước 1: Dùng Test F để kiểm tra sự đồng nhất của tập hợp kết quả thu được. Lựa

chọn hai mức nồng độ LLOQ và ULOQ để kiểm tra.

+ Thống kê giá trị hoặc tỷ lệ đáp ứng pic của các mẫu LLOQ, ULOQ;

+ Đối với mỗi nồng độ, tính sai số theo công thức: = Var (x1, x2,….xn);

x1- xn: là giá trị đáp ứng pic hoặc tỷ lệ đáp ứng pic, n là số đường chuẩn;

+ Tính Fthực nghiệm theo công thức: = Sai số của ULOQ/ sai số của LLOQ;

+ Tính Fbảng theo công thức: = FINV(0.01, n-1, n-1);

+ Nếu giá trị Fthực nghiệm lớn hơn giá trị Fbảng, chứng tỏ tập hợp kết quả không

đồng nhất, cần thiết phải sử dụng phương pháp dùng hệ số trọng số (weighting).

Bước 2: Xác định hệ số trọng số phù hợp, khảo sát trên một số mô hình

weighting hay được sử dụng nhất, là: 1, 1/x, 1/x2, 1/x1/2



60

+ Sử dụng dữ liệu của một đường chuẩn để khảo sát;

+ Với mỗi mô hình, tính % tìm lại ở mỗi điểm chuẩn, tính sai số dư bằng %

tìm lại trừ đi 100 %, tính tổng sai số dư;

+ Lựa chọn mô hình nào có tổng sai số dư nhỏ nhất;

+ Tính lại nồng độ theo phương trình hồi quy đã xây dựng được, xác định độ

đúng so với giá trị thực của từng nồng độ.

Đường chuẩn phải thoả mãn các yêu cầu sau:

- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85 – 115 %, trừ tại

điểm LLOQ được chấp nhận 80 % - 120 %; có ít nhất 75 % số điểm trong dãy

chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu

chuẩn; có hệ số tương quan r ≥ 0,95.

Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Giới hạn định lượng dưới thể hiện độ nhạy, độ chính xác, độ đúng của phương

pháp. Giá trị LLOQ nên nằm trong khoảng 1/30 – 1/10 Cmax. Nồng độ chuẩn thấp

nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là LLOQ khi thoả mãn các điều kiện sau:

Đáp ứng của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng của mẫu trắng tại cùng thời

gian lưu; Độ đúng phải bằng 80 % – 120 % so với nồng độ thực; Độ chính xác khi

tiến hành phân tích trên ít nhất 5 mẫu LLOQ độc lập phải nhỏ hơn hoặc bằng 20 %.

Xác định độ đúng và độ chính xác

Chuẩn bị mẫu LLOQ và các mẫu kiểm tra (LQC, MQC, HQC) theo bảng

2.15, mỗi nồng độ chuẩn bị 6 mẫu. Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương

trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ các mẫu kiểm tra.

Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được

với giá trị thực có trong mẫu; xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ

lệch CV % giữa giá trị các lần định lượng mỗi nồng độ được phân tích trong cùng

một ngày; xác định độ lặp lại khác ngày bằng cách tính toán độ lệch CV % giữa giá

trị các lần định lượng mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 5 ngày khác nhau.

Yêu cầu: Độ đúng tại mỗi nồng độ phải trong khoảng 85 % - 115 %, tại điểm

LLOQ được chấp nhận 80 % - 120 %; độ lặp lại trong ngày có giá trị CV % ≤ 15 %;



61

độ lặp lại giữa các ngày có giá trị CV % ≤ 15 %.

Xác định độ đúng- độ chính xác của phương pháp khi pha loãng

Chuẩn bị các mẫu khảo sát độ đúng - độ chính xác của phương pháp khi pha

loãng theo bảng 2.15 rồi tiến hành pha loãng 2 lần, xử lý và phân tích sắc ký các mẫu.

Dựa theo đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện, xác định nồng độ AV có

trong các mẫu pha loãng từ đó tính toán nồng độ AV có trong mẫu ban đầu.

Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được

với giá trị thực có trong mẫu; xác định độ chính xác bằng cách tính CV % giữa giá

trị các lần định lượng.

Yêu cầu: độ đúng phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 % so với giá trị

thực; độ chính xác với giá trị CV % không được vượt quá 15 %.

Tỷ lệ thu hồi của phương pháp

Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo qui

trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách.

Tiến hành sắc ký các lô mẫu kiểm tra gồm LQC, MQC và HQC, mỗi lô mẫu

gồm ít nhất 5 mẫu độc lập. Song song tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn pha trong dung

dịch nền mẫu có nồng độ tương ứng. Xác định tỷ lệ thu hồi của AV và IS bằng cách

so sánh kết quả đáp ứng của AV, IS trong các mẫu QC có qua chiết tách – với đáp

ứng của AV, IS trong mẫu chuẩn pha trong nền mẫu (không qua chiết tách).

Yêu cầu: Giá trị CV % giữa các đáp ứng của AV, IS trong các mẫu QC có qua

chiết tách ở mỗi nồng độ phải  15 %; giá trị CV % giữa các đáp ứng của AV, IS

trong các mẫu QC không qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 10 %;

tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ của AV không khác nhau quá  15 %.

Khảo sát độ ổn định

Độ ổn định dung dịch IS gốc dài ngày

Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch chuẩn nội gốc sau khi bảo quản ở nhiệt

độ 2o C- 8o C trong thời gian nhất định với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng.

Nồng độ dung dịch sau bảo quản sai khác với nồng độ dung dịch mới pha  5 %.



62

Độ ổn định của dung dịch IS làm việc ở nhiệt độ phòng thời gian ngắn

Phân tích, so sánh đáp ứng của dung dịch nội chuẩn làm việc sau khi để ở

nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định (4 giờ) với đáp ứng của dung dịch mới

pha tương ứng. Đáp ứng dung dịch sau bảo quản ở nhiệt độ phòng phải sai khác với

đáp ứng dung dịch mới pha không quá 5 %.

Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã

Khảo sát độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và

HQC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ - 350 C ± 50 C và để rã đông ở nhiệt độ phòng. Sau

3 chu kỳ đông – rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ AV có trong mẫu. So sánh

với kết quả xác định nồng độ AV có trong các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi

pha (nồng độ ban đầu). Nồng độ AV trong mẫu sau 3 chu kỳ đông - rã phải sai khác

với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị CV % giữa các kết quả định lượng ở

mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15 %.

Độ ổn định của mẫu huyết tương trong thời gian dài ở điều kiện bảo quản.

Phân tích nồng độ thuốc trong các mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC

được bảo quản ở nhiệt độ - 350 C ± 50 C sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất

định (11, 35 và 53 ngày). So sánh với kết quả ở thời điểm ban đầu. Nồng độ AV

trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban

đầu không quá 15 % và giá trị CV % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ

phải nhỏ hơn hoặc bằng 15 %.

Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi rã đông và để ở

nhiệt độ phòng sau một thời gian nhất định (5 giờ), so sánh với nồng độ mẫu được xử

lý ngay sau khi rã đông. Nồng độ AV trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một

thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không

quá 15 % và giá trị CV % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải  15 %.

Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler)

So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong auto –

sampler sau một thời gian nhất định (20 giờ) và nồng độ của mẫu tiêm ngay sau xử



63

lý. Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định trong auto - sampler sai

khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá 15 % và giá trị CV % giữa các kết quả

định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15 %.

2.2.2.2. Nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học in vivo

a. Thiết kế nghiên cứu

Tiến hành theo hướng dẫn thử tương đương sinh học của DĐVN IV 4 hoặc

theo hướng dẫn ASEAN 2004 30. Mô hình nghiên cứu chéo, ngẫu nhiên, đơn liều,

2 thuốc, 2 trình tự, 2 giai đoạn, nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học trong cả

2 tình trạng no và đói. Thời gian nghĩ giữa 2 giai đoa ̣n ít nhấ t là 7 ngày.

b. Người tình nguyện

Số lượng người tình nguyện (NTN)

- Số lượng NTN tham gia nghiên cứu (cỡ mẫu) được xác định dựa vào các yếu

tố : mức độ dao động trong cá thể của các thông số dược động học; mức ý nghĩa

(α = 0,05); tỉ lệ giá trị trung bình các thông số dược động học giữa thuốc thử và

thuốc đối chiếu ; giá trị độ mạnh của phép thử (power); cỡ mẫu phải đảm bảo có

tính thống kê, ít nhất phải là 12 NTN.

Tiêu chuẩn chấp nhận

- Nam hoặc nữ, khoẻ mạnh, đủ năng lực hành vi dân sự tuổi từ đủ 18 – 55;

- Chỉ số BMI về cân nặng và chiều cao phải trong khoảng từ 18,0 – 25,0 kg/m2,

theo cách tính chiều cao, cân nặng của Metropolitan Index 1983 cho người lớn;

- Xét nghiệm HIV/AIDS, HBsAg âm tính;

- Không mang thai đối với nữ giới (âm tính khi xét nghiệm nước tiểu);

- Các kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hóa nằm trong khoảng bình thường;

- Đồng ý thực hiện các yêu cầu của đề cương nghiên cứu và tự nguyện ký vào

Bản cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu.

Các tiêu chuẩn loại trừ

- NTN không đủ năng lực hành vi dân sự, không đạt các tiêu chuẩn chấp nhận,

bị nghiện ma tuý hoặc nghiện rượu; Hút thuốc lá nhiều hơn 5 điếu/ngày; Người

đang có những rối loạn về tim mạch, hô hấp, thận, tiêu hóa, miễn dịch, huyết học,



64

nội tiết, hệ thần kinh hoặc bệnh tâm thần; Người nghi ngờ có nhiễm HIV và HbsAg;

Người có tiền sử dị ứng với valproat và các thuốc cùng nhóm; Người có tiền sử

hoặc có thành viên trong gia đình có tiền sử loạn chuyển hoá porphyrin; Người mới

bị ốm trong vòng 2 tuần trước khi uống thuốc giai đoạn 1.

- Người đã dùng bất kỳ một loại thuốc nào gây cảm ứng hoặc ức chế chuyển

hoá thuốc ở gan (ví dụ: thuốc nhóm MAOIs, cimetidin, amiodaron…) trong vòng

28 ngày trước khi uống thuốc giai đoạn 1; Người mới hiến máu hoặc mới tham gia

các thử nghiệm lâm sàng khác trong vòng 90 ngày trước khi uống thuốc giai đoạn 1;

Người đã dùng cùng loại thuốc nghiên cứu hoặc các thuốc kê đơn khác trong vòng

14 ngày trước khi uống thuốc giai đoạn 1; Người có tiền sử khó nuốt, hay bệnh

đường tiêu hóa có thể ảnh hưởng tới hấp thu của thuốc; phụ nữ có thai, hoặc đang cho

con bú, hoặc dự định có thai trong vòng 2 tháng tiếp theo; NTN có tiền sử hạ huyết

áp thế đứng, hạ đường huyết khi nhịn ăn, lo sợ khi nhìn thấy máu hoặc khi lấy máu.

c. Quy trình thực hiện nghiên cứu

Dùng thuốc

- Dùng phần mềm excel để ngẫu nhiên hóa trình tự uống thuốc cho từng NTN.

Phân nhóm NTN và cho uống thuốc theo trình tự của các giai đoạn như sau:

- Liều dùng: Uống 01 viên thuốc thử hoặc thuốc đối chiếu cho mỗi giai đoạn.

Uống thuốc sau khi dùng suất ăn thử nghiệm (giàu năng lượng, nhiều chất béo) 30

phút (tình trạng no) hoặc uống thuốc sau khi nhịn ăn ít nhất 10 giờ (tình trạng đói).

- Cách dùng: Uống nguyên vẹn viên thuốc với 240 ml nước ấm. Trong vòng 2

giờ sau khi uố ng thuố c, NTN không được nằm. Kiểm tra miệng ngay sau khi cho

uống thuốc để đảm bảo NTN đã nuốt viên thuốc.

- Các cán bô ̣ tham gia quản lý NTN, lấy mẫu và phân tích mẫu NTN đều

không được biết trình tự dùng thuố c của từng NTN. Mã thuốc chỉ được thông báo

cho thầy thuốc trong trường hợp cần cấp cứu, và chuyển cho cán bộ thống kê khi

tính kết quả và làm báo cáo cuối cùng.

Lấy mẫu máu

- Thời điểm lấy (giờ): 0, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 24, 36, 48 & 72



65

- Điểm 0 giờ được lấy trong vòng 1 giờ trước khi uống thuốc. Các mẫu máu

trong khoảng 16 giờ đầu sau khi uống thuốc được phép lấy lệch trong vòng 5 phút

và điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 72 giờ được phép lấy lệch trong vòng 30 phút so

với thời gian qui định. Các điểm lấy mẫu chênh lệch quá thời gian qui định trên

được coi là sai khác với đề cương và sẽ được hiệu chỉnh thời gian khi tính thống kê.

- Thể tích máu: Với mỗi NTN, mỗi điểm lấy khoảng 6 ml máu.

- Cách lấy mẫu: Các mẫu máu được lấy qua một kim luồn đặt cố định ở cánh

tay NTN. Mỗi thời điểm sau khi uống thuốc, lấy khoảng 5,5 ml máu sau khi đã loại

bỏ khoảng 0,5 ml máu đầu chứa chất chống đông (dung dịch NaCl 0,9 % chứa

heparin 5UI/ml) hoặc có thể lấy mẫu trực tiếp qua tĩnh mạch cánh tay. Các điểm 24,

36, 48 và 72 giờ lấy khoảng 5,5 ml máu trực tiếp từ tĩnh mạch cánh tay.

Xử lý và bảo quản mẫu

Mẫu máu sau khi lấy được cho vào ống có ghi nhãn chứa chất chống đông

Na2EDTA (2 mg/ml máu). Lắc ống bằng cách lật ngược ống 3 - 4 lần ngay sau khi

cho máu vào. Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Tách lớp huyết

tương cho vào các ống polyethylen có dán nhãn, bảo quản ngay ở nhiệt độ – 35oC 

5oC cho đến khi phân tích. Nhãn trên ống đựng máu và ống đựng huyết tương ghi

các thông tin: mã số NTN, số nghiên cứu, giai đoạn, thời điểm lấy mẫu.

Phương pháp phân tích mẫu huyết tương NTN sau khi uống thuốc.

- Xác định nồng độ AV trong huyết tương bằng phương pháp UHPLC/MSMS. Tính nồng độ AV dựa trên đường chuẩn hồi quy thực nghiệm có dạng y = aX

+b. Trong đó, y là tỷ lệ đáp ứng pic của AV/IS, X là nồng độ hoạt chất trong mẫu.

Xác định các thông số dược động học và đánh giá tương đương sinh học

- Xác định các thông số dược động học

Các thông số được xác định trực tiếp dựa trên kết quả đo : Cmax, Tmax.

Thông số AUC được tính dựa theo phương pháp hình thang theo công thức:

n



AUC01  

i 1



Ci  Ci 1

(ti 1  ti )

2



(2.19)



Và công thức ngoại suy tính AUC0- theo công thức :

(2.20)