CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

30

Bảng 2. 2. Các chất chuẩn, hóa chất tinh khiết dùng trong kiểm nghiệm thành phẩm

Tên hóa chất



Tiêu chuẩn



Nguồn gốc



Natri valproat (lô 2939, HLNT : 98,5 %)



Chất chuẩn



BP, Anh



Acid valproic (lô M0G249, HLNT : 99,9 %)



Chất chuẩn



USP, Mỹ



Chuẩn tạp A ( lô H0I276, HLNT : 100 %)



Chất chuẩn



USP, Mỹ



Acid hydrocloric



Tinh khiết



Trung Quốc



Natri hydroxyd



Tinh khiết



Trung Quốc



Natri dihydrophosphat



Tinh khiết



Trung Quốc



Natri lauryl sulfat



Tinh khiết



Trung Quốc



Kali dihydrophosphat



Dùng cho LC



Trung Quốc



Acetonitril



Dùng cho LC



Merck, Đức



Methanol



Dùng cho LC



Merck, Đức



Acid phosphoric



Dùng cho LC



Trung Quốc



Bảng 2. 3. Các mẫu huyết tương trắng dùng thẩm định phương pháp phân tích hoạt

chất trong dịch sinh học

Mẫu



Lô



Nơi cung cấp



01



15P001270



Viện huyết học – truyền máu TW



02



15P001371



Viện huyết học – truyền máu TW



03



15P001587



Viện huyết học – truyền máu TW



04



15P001720



Viện huyết học – truyền máu TW



05



15P001958



Viện huyết học – truyền máu TW



06



15P001968



Viện huyết học – truyền máu TW



Bảng 2. 4. Các dung môi dùng thẩm định phương pháp phân tích hoạt chất trong

chế phẩm.

Tên thuốc thử



Độ tinh khiết



Số kiểm soát



Acetonitril



Dùng cho LC



I716091 345



Merck, Đức



Methanol



Dùng cho LC I715918 346



Merck, Đức



Acid formic



Dùng cho LC



Sigma-Aldrich, Mỹ



BCBK9295V



Nhà sản xuất



31

Bảng 2. 5. Các chất chuẩn dùng thẩm định phân tích hoạt chất trong huyết tương.

Tên

Acid valproic



Mục đích



Nơi sản



Số kiểm



Hàm



sử dụng



xuất



soát



lượng



Chuẩn làm việc



Methylparaben Chuẩn nội



Ấn Độ



VA/11/014



Độ ẩm



99,31%



0,50 %



VKNTTW 0213108.02 99,74%



0,05 %



2.1.1.2. Trang thiết bị

Các trang thiết bị, máy móc dùng trong bào chế, kiểm nghiệm và đánh giá

tương đương sinh học được tóm tắt lần lượt trong bảng 2.6 và bảng 2.7.

Bảng 2. 6. Danh sách thiết bị dùng trong bào chế và kiểm nghiệm

Tên thiết bị



Nhãn hiệu



Nhà sản xuất



Cân điện tử (12 kg)



EK-12 Ki



A&D Company Limited, Nhật bản



Cân điện tử (200 g)



EK-200i



A&D Company Limited, Nhật bản



Máy tạo hạt siêu tốc



HLSG 5; HLSG 10



Zhejiang machinery, Trung Quốc.



Máy trộn lập phương



V 5; V 60



Armephaco, Việt Nam



Máy dập viên



ZP -7



Shanghai Yali, Trung Quốc.



Máy bao phim tự động BG 20 D



Zhejiang Jiangnan , Trung Quốc



Tủ sấy tĩnh



Binder



Binder, Pháp.



Máy xát hạt



YK - 160



Tianjin Co., Ltd, Trung Quốc.



Máy sửa hạt xoay tròn



XH - 250



Công ty Tuấn Thắng, Việt Nam.



Máy xay búa inox



MXB-100



Công ty cơ khí T&T, Việt Nam.



Máy ép vỉ bấm



Noack



Noack, Thái Lan.



Máy đo độ hòa tan



Hanson Vision



Hanson Research, Mỹ.



Máy đo độ cứng



Copley TBF 1000



Copley, Anh



Máy đo độ mài mòn



Copley FR 1000



Copley, Anh



Máy đo tỷ trọng hạt



Copley JV 1000



Copley, Anh



Máy đo độ lưu biến



Copley Scientific



Copley, Anh



Máy đo độ ẩm



MB - 45



Ohaus – Mỹ



Cân phân tích



Sartorius TE 214S



Sartorius, Đức



Hệ thống HPLC



Dionex ultimate 3000 Dionex, Mỹ



32

Bảng 2. 7. Các thiết bị sử dụng để đánh giá tương đương sinh học

Thiết bị



Mã thiết bị/ Số series Nhà sản xuất



Thiết bị UHPLC - MS/MS



VKN/TĐSH/53.03



Waters, Mỹ



Cân phân tích



VKN/TĐSH/01.21



Sartorius-CP224S, Đức



Máy lắc xoáy



20220176



Velp, Ý



Tủ lạnh âm sâu –350C ± 50C



VKN/TĐSH/33.02



Sanyo MDF– Nhật Bản



Tủ lạnh bảo quản chuẩn



VKN/TĐSH/38.14



Haier, Trung Quốc



Máy ly tâm lạnh



VKN/TĐSH/46.04



Sigma 2-16K, Đức



Thiết bị lọc nước



9664/10



TKA, Đức



Cột C18 : 100 x 2,1 mm; 1,7 µm



705802-3



Phenomenex, Mỹ



2.1.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Sản phẩm thuốc đối chiếu: Viên PTKD Depakine Chrono 500 mg (chứa 145

mg acid valproic và 333 mg natri valproat, tương ứng 500 mg natri valproat) do

công ty Sanofi Winthrop - Pháp sản xuất với các lô sử dụng bao gồm :

+ Số lô: 1A662, NSX: 11/2012, HD: 10/2015, SĐK: VN- 4095 - 07 được sử

dụng so sánh trong nghiên cứu bào chế. Hàm lượng thuốc 100,2 %.

+ Số lô: 3A780, NSX : 09/13; HD: 08/2016 ; SĐK: VN – 16477 - 13 được sử

dụng trong nghiên cứu tương đương sinh học. Hàm lượng thuốc đạt 102,1%.



Hình 2. 1. Ảnh thuốc đối chiếu Depakine Chrono 500 mg

- Sản phẩm thử (sản phẩm nghiên cứu) và nơi nghiên cứu:

+ Tên sản phẩm: Viên PTKD chứa 145 mg acid valproic và 333 mg natri

valproat tương ứng với 500 mg natri valproat.



33

+ Mô tả kích thước viên: Viên bao phim màu trắng hơi ngà, hình caplet, chiều

dài 18,8 mm, bề ngang 8 mm, bề dày 5,6 mm. Một mặt nhẵn, một mặt có vạch

ngang, cạnh và thành viên lành lặn.

+ Nguồn gốc và nơi nghiên cứu: Sản phẩm sản xuất tại Công ty cổ phần dược

Danapha, số 253 - Dũng Sĩ Thanh Khê, Quận Thanh Khê, Thành phố Đà Nẵng.

- Sản phẩm thử nghiệm được lấy từ lô sản xuất qui mô 20.000 viên (lô P

030614; ngày sản xuất 10/06/2014), có chất lượng đạt tiêu chuẩn cơ sở, với hàm

lượng hoạt chất đạt 100,5 %.

2.1.2.2. Phạm vi nghiên cứu

Trong phạm vi của đề tài này gồm nghiên cứu xây dựng được công thức và

qui trình sản xuất ở qui mô phòng thí nghiệm, làm cơ sở để nghiên cứu nâng cấp lên

qui mô sản xuất 20.000 viên. Qui trình phải đạt độ ổn định cần thiết để sản xuất và

có khả năng nâng cấp được lên qui mô sản xuất lớn hơn. Sản phẩm phải đạt tương

đương hòa tan in vitro với thuốc đối chiếu, để đảm bảo cho thử nghiệm đạt tương

đương sinh học. Xây dựng và hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm, đánh giá

chất lượng, độ ổn định, thử tương đương sinh học của sản phẩm so với thuốc đối

chiếu Depakine Chrono 500 mg để hoàn tất thủ tục xin đăng ký cấp phép sản xuất.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu về bào chế

2.2.1.1.Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng hoạt chất

trong thành phẩm bằng phương pháp HPLC.

Dựa trên tính chất chuyển đổi NV thành AV tự do trong pha động chạy sắc ký.

Đề tài tiến hành xây dựng phương pháp định lượng AV và NV trong cùng chế phẩm

bằng phương pháp HPLC.

Xây dựng phương pháp

Xử lý mẫu

- Dung dịch đệm pH 2,7: Cân 2,72 g KH2PO4 hòa tan trong 900 ml nước, chỉnh

về pH 2,7 bằng dung dịch H3PO4 10 %. Thêm nước cất vừa đủ 1000 ml. Lọc qua

màng lọc sartorius RC 0,45µm.



34

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 100 mg natri valproat chuẩn cho vào

bình định mức 50 ml, thêm khoảng 5 ml methanol, siêu âm 2 phút, thêm nước cất

vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc sartorius RC 0,45 µm.

- Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột viên (được nghiền mịn từ 20

viên) tương ứng với khối lượng của 1/5 viên (tương đương với khoảng 100 mg natri

valproat đã qui đổi) cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 5 ml methanol, lắc

mạnh cho tới khi polyme trương nở hoàn toàn, siêu âm 2 phút, thêm nước cất vừa

đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc sartorius RC 0,45 µm.

Điều kiện sắc ký:

Các điều kiện sắc ký được nghiên cứu khảo sát bằng thực nghiệm, bao gồm :

- Cột: Acclaim C8 (100 x 4,6 mm, 3 µm).

- Bước sóng phát hiện: 210 nm.

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

- Thể tích tiêm: 10 µl.

- Pha động: Acetonitril: đệm phosphat 2,7 (55:45).

- Thời gian phân tích một mẫu: 5 phút.

Tiế n hành sắc ký và tính toán kết quả:

Hàm lượng natri valproat tính theo công thức:

Trong đó:



HL% 



ST  mC  M

 C 100

SC  mT  0,5



(2.1)



ST : DT pic dung dịch thử (mAU* phút); SC :DT pic dung dịch chuẩn (mAU* phút);

mT: Khối lượng cân (g) mẫu thử;



mC: Khối lượng cân (g) mẫu chuẩn;



C: Hàm lượng chuẩn.



M : khối lượng trung bình viên (g);



Thẩm định quy trình định lượng

Tiến hành thẩm định qui trình HPLC định lượng hoạt chất trong chế phẩm

theo hướng dẫn của ICH, thực hiện trên mẫu sản phẩm thử

Kiểm tra tính tương thích hệ thống

Tính tương thích hệ thống được xác định bằng cách phân tích trong cùng điều



35

kiện 6 mẫu dung dịch chuẩn có cùng nồng độ. Đánh giá độ lặp lại của diện tích pic

và thời gian lưu dựa trên giá trị hệ số phân tán (CV %).

Tính đặc hiệu

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và mẫu thử có cùng nồng độ xấp xỉ 2 mg/ml

natri valproat trong nước (được chuẩn bị giống như mục 2.2.1.1).

Dung dịch mẫu placebo: Cân một lượng bột placebo tương ứng của 1/5 viên

(tương ứng khoảng 55,2 mg placebo) cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 5

ml methanol, lắc mạnh cho tới khi polyme trương nở hoàn toàn, siêu âm 2 phút,

thêm vừa nước cất đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc sartorius RC 0,45 µm.

Tiến hành sắc ký các mẫu placebo, chuẩn, thử và dung môi pha động. Đánh

giá tính đặc hiệu của phương pháp dựa trên pic của mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu

placebo, dung môi pha động và độ tinh khiết của pic dựa trên so sánh phổ UV tại

các điểm khác nhau trên pic.

Tính tuyến tính

Tiến hành khảo sát trong khoảng nồng độ từ 1,19 - 2,76 mg/ml (tương đương

60 – 140 % so với nồng độ dung dịch chuẩn là 2 mg/ml natri valproat). Sắc ký các

mẫu chuẩn trên theo điều kiện sắc ký đã chọn, mỗi nồng độ phân tích 1 lần.

Lập phương trình hồi quy có dạng y = ax + b xác định mối tương quan giữa

nồng độ hoạt chất với diện tích pic. Kiểm tra hệ số a, b và tính tương thích của

phương trình hồi quy bằng thống kê.

Độ chính xác

Tiến hành trên 6 mẫu thử cùng nồng độ để xác định RSD % so với yêu cầu.

Độ chính xác trung gian

Hai kiểm nghiệm viên tiến hành phân tích các mẫu tự tạo có nồng độ xấp xỉ

natri valproat là 2 mg/ml trên hai hệ thống HPLC khác nhau trong hai ngày khác

nhau. Mỗi kiểm nghiệm viên thực hiện trên 6 mẫu. Xác định độ lặp lại khác ngày

dựa trên CV % và so sánh kết quả trung bình định lượng của 2 kiểm nghiệm viên.

Độ đúng

Chuẩn bị các mẫu giả định có nồng đô ̣ bằ ng 80 %, 100 % và 120 % so với