VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Máy cất nước

- Máy quang phổ Genesys 20

3.2.2.2. Dụng cụ

-



Pipette



-



Erlen



-



Ống đong



-



Cân điện tử 2 số lẻ Sartorius TE 612



-



Cân điện tử 4 số lẻ Sartorius TE 214 S



-



Cá từ



-



Becher



-



Giấy lọc đường kính 11 cm



-



Lọ tiêu bản



-



Ống vi quản



-



Bản mỏng silicagel Merk, kích thước 20 x 20 cm



3.2.3. Hóa chất thí nghiệm

- n-hexan

- Aceton

- Silicagel 230-400 mesh

- Diethyl ether

- Acid acetic

- Tinh thể iôt

- Nước cất

- Cồn

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ aceton đến hiệu suất dầu thu

được bằng sắc ký cột silicagel qua 3 giai đoạn và một giai đoạn

Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ aceton đến tỉ lệ dầu thu được cho sắc ký cột 3

giai đoạn và 1 giai đoạn và xác định phương pháp tinh chế dầu tối ưu.

Yếu tố nghiên cứu: Ảnh hưởng của tỉ lệ aceton đến hiệu suất thu hồi dầu tinh.

25



Yếu tố cố định: Khối lượng silicagel so với khối lượng dầu tảo.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD)

gồm một yếu tố chính (tỉ lệ aceton) và 1 yếu tố ngoại cảnh (hàm lượng dầu qua các đợt

ni).

Khối 1



Khối 2



1



2



2



3



3



4



4



1



Nghiệm thức



Trong đó:

Phương pháp



3 giai đoạn (3gđ)



1 giai đoạn (1 gđ)



Nghiệm thức



1



2



3



4



Thể tích aceton sử dụng trong gđ2



20



40



60



_



Ghi chú: Nghiệm thức 1, nghiệm thức 2 và nghiệm thức 3 trong phương pháp 3

giai đoạn: giai đoạn 1 chạy cột với dung môi là hexan, giai đoạn 2 rửa cột bằng aceton để

loại chlorophyll, giai đoạn 3 cột được chạy lại với hexan.

Nghiệm thức 4 trong phương pháp 1 giai đoạn: đẩy hoàn toàn vệt màu vàng ra khỏi

cột bằng dung môi là hexan.

Khối 1: Tảo Chlorella vulgaris được ni tại hệ thống 40 lít ngồi trời từ ngày 26

tháng 2 đến ngày 6 tháng 3 năm 2012mật độ tảo là 28 triệu ml/tb (mililit/tế bào).

Khối 2: Tảo Chlorella vulgaris được ni tại hệ thống 40 lít ngồi trời từ ngày 8

tháng 3 đến ngày 15 tháng 3 năm 2012,mật độ tảo là 10 triệu ml/tb (mililit/tế bào).

 Phương pháp thực hiện:

Chuẩn bị cột: Cột sắc ký có kích thước 1,6 x 30 cm, lượng silicagel mỗi lần nhồi là

8 gram, kích thước hạt 230- 400 mesh, dung mơi giải ly là hexan. Cột được ngâm 15 phút

trước khi giải ly.



26



Phương pháp 3 giai đoạn:

• Giai đoạn 1: giải ly cột bằng dung môi hexan, thu dịch khi vệt dầu màu

vàng vừa xuất hiện (UV= 0.01 A đo ở bước sóng 450 nm).

• Giai đoạn 2: dùng aceton loại vệt chlorophyll trên cột.

• Giai đoạn 3: sau khi rửa cột bằng aceton, cột được giải ly lại bằng hexan để

thu dịch dầu.

Dầu tảo thơ

Pha lỗng bằng

hexan



Giai đoạn 1

UV=0,01A



Sắc ký cột silicagel



Giai đoạn 2

Aceton



Hexan



Cột silicagel loại chlorophyll



Dịch dầu+Hexan



Giai đoạn 3



Cô quay, Sấy chân không



Hexan



Dịch dầu +Hexan



Dầu tinh cấp 1



Cô quay, Sấy chân không

Dầu tinh cấp 1

Aceton+khuấy từ

Dầu tinh cấp 2



Dầu tảo tinh

Hình 3.1: Quy trình chạy sắc ký cột bằng phương pháp ba giai đoạn

Thuyết minh quy trình: cân 0,25 gram dầu tảo thơ, đem pha lỗng 100 lần bằng

dung môi là hexan. Hỗn hợp sẽ được chạy qua cột. Cột được chạy đến khi vết dầu màu

27



vàng xuất hiện, dịch này còn khá nhạt nên cho chạy cột lại một lần nữa, những mẫu dịch

sau đem đo UV, khi UV đạt 0,01 A tiến hành thu dịch dầu và đổ khoảng 40 ml hexan mới

vào cột. Cột được chạy cho đến hết lượng hexan mới đổ vào. Tiến hành thu dịch dầu và

hexan. Dung dịch dầu và hexan thu được đem cô quay ở nhiệt độ 80oC. Dịch thu được sau

cô quay đem sấy chân không ở nhiệt độ 40 oC, trong 24 giờ.

Cột silicagel sau khi ta tiến hành thu dịch trên đem rửa với lần lượt 20 ml, 40ml, 60

ml aceton để loại chlorophyll. Sau đó giải ly cột với 40ml hexan, thu dịch này và đem cô

quay ở 80 oC, sấy chân không ở 40oC trong 24 giờ. Dầu này sau đó được đem khuấy từ

với aceton ở 40 oC và 750 rpm. Dùng kim bơm hút bỏ phần tạp chất hòa tan vào aceton,

đem sấy chân khơng dịch còn lại ở 40oC trong 24 giờ.

 Kiểm tra UV dịch thu được bằng máy quang phổ, bước sóng 450 nm:

Cách tiến hành:

Dùng pipet lấy dịch thu được từ bình cho vào ống nghiệm, lắc đều phần dịch trong

ống nghiệm.

Bật máy UV, chọn bước sóng và chế độ đo độ hấp thu.

Rửa cuvet từ 2 đến 3 lần bằng nước cất, tráng lại cuvet bằng hexan. Sau đó cho

hexan vào cuvet, đặt cuvet vào máy và set mẫu trắng.

Lấy dịch từ ống nghiệm tráng cuvet từ 2 đến 3 lần rồi sau đó cho dịch vào cuvet,

đặt cuvet vào máy và đọc số liệu hiển thị trên màn hình.





Tinh chế dầu tinh cấp 1:



Dầu tinh cấp 1 được tinh chế bằng cách khuấy từ với aceton ở 40 oC và 750 rpm.

Thể tích aceton cho vào để khuấy từ được căn cứ vào khối lượng dầu tinh cấp 1: thể tích

aceton bằng 20 lần khối lượng dầu tinh cấp 1.

Phương pháp 1 giai đoạn: đẩy hoàn toàn vệt màu vàng qua vệt chlorophyll trên

cột.



28



Dầu tảo thô

n-Hexan

Sắc ký cột silicagel



Dịch dầu+hexan

Cô quay, Sấy chân không

Dầu tinh cấp 1

Aceton +khuấy từ

Dầu tảo tinh



Hình 3.2: Quy trình chạy sắc ký cột bằng phương pháp một giai đoạn

Cân 0,25 gram dầu tảo thơ, đem pha lỗng 100 lần bằng dung mơi là hexan. Hỗn

hợp sẽ được chạy qua cột. Dung môi giải ly được hoàn lưu trở lại cột đến khi UV (đo ở

bước sóng 450nm) khơng tăng hoặc giảm, tiến hành thu dịch dầu và hexan. Giải ly cột

đến khi vết màu vàng trên cột trở nên nhạt màu. Dung dịch dầu và hexan thu được đem cô

quay ở nhiệt độ 80oC. Dịch thu được sau cô quay đem sấy chân không ở nhiệt độ 40 oC,

trong 24 giờ. Dầu này sau đó được đem khuấy từ với aceton ở 40 oC và 750 rpm (tinh chế

dầu tinh cấp 1). Dùng kim bơm hút bỏ phần tạp chất hòa tan vào aceton, đem sấy chân

khơng dịch còn lại ở 40oC trong 24 giờ.



29



3.3.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu tinh chế dầu tảo bằng phương pháp sắc ký cột 2

giai đoạn.

Mục đích thí nghiệm: nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ khối lượng silicagel và dầu

tảo thích hợp để thu được dầu tảo có độ tinh khiết cao.

Yếu tố nghiên cứu: tỉ lệ khối lượng thích hợp của silicagel và dầu tảo.

Yếu tố cố định: khối lượng silicagel so với khối lượng dầu tảo.

Chỉ tiêu đánh giá: hiệu suất thu hồi dầu tinh, thể tích hexan cần dùng để chạy cột.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ

(RCBD). Bố trí 2 khối, mỗi đợt nguyên liệu là một khối.

Khối



Nghiệm thức

Tỉ lệ dầu tảo/silicagel

(g/g)



1



2



0.5/8



0.75/8



0.75/8



1/8



1/8



0.5/8



Ghi chú: Khối 1 và 2: tảo Chlorella Vulgaris thiết bị 40 lít trong 2 đợt khác nhau.



30



Phương pháp thực hiện:

Dầu thô

Giai đoạn1



Sắc ký cột



Bã silicagel



Dầu tinh 1,

UV≤0,001 A



Dầu không tinh,

UV> 0,001A



Giai đoạn2



Ngâm hexan

Chạy cột



Sắc ký cột



Thu



Dầu tinh 2



Dầu tinh1



Hình 3.3: Quy trình chạy sắc ký cột qua 2 giai đoạn

Mơ tả thí nghiệm: Cột sắc ký được nhồi với khối lượng silicagel là 8 gram, chiều

cao cột nhồi là 11cm. Dầu tảo thơ được pha lỗng với hexan theo tỉ lệ 1/100 (theo khối

lượng).

 Giai đoạn 1: Tiến hành chạy cột và đo UV dịch thu được. Khi độ UV đạt 0,001 A,

tiến hành thu dịch, cho đến khi độ hấp thu quang bằng 0. Cô quay dịch thu được và đem

sấy ở 40 oC, trong 24 giờ.

Trường hợp dịch có UV >0,001 A, thu dịch đó (dịch B) và tiếp tục chạy cột với

hexan. Khi UV dịch mới đạt 0,001 A, thu dịch, cho đến khi độ quang giảm xuống 0 A. Cô

quay dịch thu được và đem sấy ở 40 oC, trong 24 giờ. Đối với phần dịch có độ hấp thu

OD >0,001 A (dịch B), tiếp tục giải ly với hexan trên cột mới với khối lượng silicagel

nhồi là 6 gram. (Phần dịch này loãng hơn ban đầu nên ta giảm bớt khối lượng silicagel

nhồi trên cột).



31



Giai đoạn 2: bã silicagel được ngâm hexan trong 1 giờ, sau đó đem lọc phần dịch.

Phần dịch này được chạy sắc ký cột với các bước giống như giai đoạn 1.

3.3.3. Thí nghiệm 3: Tách phân đoạn dầu tảo bằng sắc ký cột silicagel với tỉ lệ dung

môi theo hai phương pháp: phương pháp của George A. Fischer và Jon J. Kabara

(1964) và phương pháp cải biên của đề án EEP-3-V-053

Mục đích thí nghiệm: Nghiên cứu tách phân đoạn dầu tảo bằng phương pháp sắc

ký cột silicagel theo phương pháp của Fischer và Kabara, so sánh hai phương pháp: phân

đoạn dầu theo tỉ lệ dung môi của phương pháp Fischer +Kabara (cột 1) và phân đoạn dầu

theo tỉ lệ dung môi của phương pháp cải biên đề án EEP-3-V-053 (cột 2).

Yếu tố nghiên cứu: Tỉ lệ dung mơi thích hợp dùng phân đoạn dầu

Yếu tố cố định: Khối lượng dầu tảo so với khối lượng silicagel.

Chỉ tiêu đánh giá: Tỉ lệ dầu qua các phân đoạn, màu sắc dầu qua các phân đoạn.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ

(RCBD). Thí nghiệm có 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 2 lần lặp lại, bố trí 2 khối,

mỗi đợt nguyên liệu là một khối.

Khối



Tỉ lệ dung môi



1



2



(20:50:70)



(22:57:79)



(22:57:79)



(20:50:70)



32



Phương pháp thực hiện:

Dầu tảo thô (0.2 g)



Sắc ký cột silicagel, phân

đoạn 1

5% Diethyl ether trong hexan

Sắc ký cột silicagel, phân

đoạn 2

15% Diethyl Ether trong Hexan

Sắc ký cột silicagel, phân

đoạn 3

Hình 3.4: Quy trình tách phân đoạn dầu theo hai phương pháp: của Fisher và Kabara và

của đề án EEP-3-V-053

Cột silicagel có kích thước 1,6 x 30 cm, khối lượng silicagel nhồi cột là 8 g, chiều

cao cột nhồi là 11 cm, cột được hoạt hóa bằng hexan trước 15 phút trước khi giải ly. Khối

lượng dầu tảo thơ là 0,2 g, mẫu được pha lỗng bằng 12 ml hexan. Cột được chạy phân

đoạn với các dung môi lần lượt là:

Cột 1 theo Fisher



Cột 2 theo tỉ lệ cải biên



+Kabara



của đề án EEP-3-V-053



Hexan



20



22



2



5% Diethyl ether+hexan



50



57



3



15% Diethyl ether+hexan



70



79



Phân đoạn



Thể tích tổng (ml)



1



Ghi chú: đã có 12 ml hexan khi pha loãng, cộng với 20 ml lúc chạy.

33



3.3.4. Thí nghiệm 4: Định tính các thành phần trong dầu phân đoạn (tỉ lệ dung môi

theo phương pháp cải biên của đề án EEP-3-V-053) bằng phương pháp sắc ký bản

mỏng

Mục đích thí nghiệm: Kiểm tra các thành phần dùng sắc ký bản mỏng của dầu đã

qua phân đoạn bằng sắc ký cột silicagel theo tỉ lệ dung môi dựa trên phương pháp của đề

án EEP-3-V-053.

Yếu tố nghiên cứu: Thành phần của dầu trong các phân đoạn.

Phương pháp thực hiện:

Chuẩn bị mẫu dầu trong các

phân đoạn



Chuẩn bị tấm bản mỏng, ống

vi quản, dung mơi giải ly



Dùng ống vi quản chấm ít

mẫu lên bản mỏng



Khai triển giải ly để dung môi

di chuyển lên



Sấy khơ tấm bản mỏng



Hiện hình các vết trên bảng

mỏng bằng H2SO4 50%

Hình 3.5: Các bước chuẩn bị và tiến hành sắc ký bản mỏng

34



Mơ tả thí nghiệm:

Chuẩn bị bản mỏng: bản mỏng có kích thước 4 x 8 cm, dùng bút chì vót nhọn vạch

mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1 cm, mức tiền tuyến dung môi cách mép trên

0,3 cm

Lựa chọn dung môi: theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) chọn hệ dung môi là

hexan : diethyl ether : acid acetic (90:20:1,5)

Chuẩn bị mao quản: mao quản có chiều dài 7 cm, đường kính 1,5 – 1,6 mm, mao

quản dùng để hút dung dịch chấm lên bản mỏng u cầu mao quản phải có đường kính bé

hơn, với kích thước này quá lớn để lấy mẫu chạy bản mỏng, các vết mẫu sẽ rất to làm kết

quả khơng chính xác. Để có mao quản nhỏ cần phải vuốt nhọn mao quản bằng cách: hai

tay cầm hai đầu ống, đặt phần giữa ống lên ngọn lửa đèn cồn, vừa hơ vừa xoay tròn đều

ống đến khi đoạn giữa mao quản trở nên mềm dẻo, đưa ống ra khỏi ngọn lửa, dùng hai tay

kéo hai đầu ống dang ra hai phía. Khi đó, phần ống mao quản ở giữa trở nên và hẹp hơn.

Ống mao quản cứng lại, bẻ ống ra làm đôi ở chỗ đã được kéo nhỏ.

Đưa mẫu lên bản mỏng: hòa tan mẫu bằng 0,2 ml hexan. Dùng mao quản đã vuốt

nhọn nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch mẫu

vào mao quản. Cẩn thận nhẹ nhàng chấm mẫu lên bảng mỏng tại vạch xuất phát. Chạm

vào và lấy mao quản ra khỏi bề mặt bản mỏng thật nhanh để dung dịch mẫu thấm vào bản

mỏng tạo thành một điểm tròn nhỏ vì nếu chạm lâu điểm này sẽ lan rất to. Để khơ dung

mơi hexan ngồi khơng khí khoảng 5 phút. Lặp lại 3 lần như trên ta được một bản mỏng

có chứa mẫu dùng để chạy sắc ký.

Tiến hành triển khai dung môi: Hệ dung môi để trong lọ tiêu bản để yên trong

15 - 30 phút cho bão hòa. Cầm bản mỏng thẳng đứng và nhúng vào lọ tiêu bảng có chứa

dung mơi, nhẹ nhàng để bản mỏng tựa vào thành cốc nghiêng một góc khoảng 15o. vị trí

vết chấm mẫu nằm trên cao cách mặt thống của dung mơi khoảng 0,5 cm.

Hiện hình các vết chấm mẫu sau khi triển khai bằng H2SO4 50%, sấy 105 oC trong

15 phút.

3.3.5. Xử lý số liệu:

35