Hình 2.3: Cấu trúc của phospholipid [8]

Trong đó:

R1, R2 là các acid béo

X: amino alcohol hoặc sugar alcohol

X gồm 4 nhóm chính: choline, ethanolamine, serine, inositol. Sẽ tạo thành các

phophatide lần lượt là: Phosphatidyl choline, Phosphatidyl ethanolamine, Phosphatidyl

serine, Phosphatidyl inositol.

Có hai loại phospholipid: phospholipid hydrat hóa được và khơng hydrat hóa được.

• Phospholipid hydrat hóa được (phosphatidylcholine and phosphatidylinositol) có

thể loại bỏ được bằng nước. Quá trình loại gum bằng nước điển hình sẽ loại bỏ các

phospholipid hydrat hóa được ở một mức độ còn khoảng 200 ppm (phần triệu) đối với

dầu nành và dầu từ hạt cải dầu .[18]

Phospholipid khơng hydrat hóa được (phosphatidic acid and lysophosphatidic

acid) thì khơng hydrat được bằng nước nên khơng thể trương nở và hình thành dạng gel

nên quá trình loại bỏ khá phức tạp và đòi hỏi ở nhiệt độ cao sử dụng phosphoric acid,

citric acid hoặc những chất khác.[18]

2.4.



Tổng quan sắc ký cột, sắc ký bản mỏng



2.4.1. Lịch sử phương pháp sắc ký [9]

Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tswett (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát

minh ra kĩ thuật sắc kí vào năm 1903 khi ơng đang nghiên cứu về chlorophyll.

Tên gọi: Chromatography: Sắc ký nghĩa là ghi màu, trong tiếng Hy Lạp chữ

chroma có nghĩa là màu, nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga vừa là màu của

các sắc tố thực vật ơng phân tích lúc bấy giờ, còn graphein là viết. Tên này vẫn tiếp tục

được dùng dù các phương pháp này còn được sử dụng để tách các chất không màu.

Năm 1938, Izmailov và Schraiber đã xây dựng và sau đó năm 1958, Stahl đã hoàn

thiện phương pháp sắc ký lớp mỏng.

Sắc ký tiếp tục phát triển không ngừng nhờ vào những kết quả nghiên cứu của

Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge trong suốt những năm

thập niên 40 và 50 của thế kỷ 20. Hai ông đã đưa ra những nguyên tắc và kỹ thuật cơ bản



14



của sắc ký phân bố làm động lực cho sự phát triển của nhiều phương pháp sắc ký khác

nhau như sắc ký giấy (PC), sắc ký khí (GC) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC).

Sắc ký khí phát triển mạnh mẽ vào những năm 1960, trong khi đó sự ra đời của sắc

ký lỏng cao áp vào cuối thập niên 60 là một bước ngoặt mới trong lịch sử sắc ký. Ngày

nay chúng được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm hiện đại trên toàn thế giới

Sắc ký là một phương pháp vật lí để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng

thành từng chất đơn lẻ, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với

một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh).[9]

Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh tách riêng các hợp chất trong

một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp thu của nó. Pha tĩnh là chất rắn thường là

alumin hoặc silicagel đã được xử lý, nó có thể được nạp nén vào trong một cột (sắc ký cột

hở), hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề mặt một tấm kiếng, tấm nhôm

hoặc tấm nhựa (sắc ký lớp mỏng).

Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí. Chất khí được sử dụng trong kỹ thuật

sắc ký khí, trường hợp này chất khí được gọi là khí mang hoặc khí vectơ. Chất lỏng dùng

trong sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, lúc này chất lỏng gọi là dung môi giải ly

[9].

2.4.2. Phân loại các phương pháp sắc ký

Theo bản chất của hai pha sử dụng:

Pha động



Pha tĩnh



Tên gọi của kỹ thuật sắc ký



Chất lỏng



Chất rắn Sắc ký lỏng-rắn (sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng)



Chất khí



Chất rắn Sắc ký khí-rắn (gọi chung là sắc ký khí)



Chất lỏng



Chất khí Sắc ký lỏng-lỏng (sắc ký HPLC với cột nhồi

C18)



Chất khí



Chất khí Sắc ký khí-lỏng (gọi chung là sắc ký)



Theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình tách chất:

Sắc ký phân chia

Sắc ký hấp thu

Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký lọc gel

15



Theo cấu hình:

Hình học Cấu hình sắc ký



Chiều di chuyển của

pha động



Loại sắc ký



Phẳng



Giấy



Đi lên, đi xuống, từ

tâm lan tỏa tròn



Phân chia



Phẳng



Lớp mỏng



Đi lên, đi xuống, từ

tâm lan tỏa tròn



Hấp thu, phân chia, trao đổi

ion, lọc gel



Cột



Cột hở



Đi xuống



Hấp thu, phân chia, trao đổi

ion, lọc gel



Cột



Sắc ký khí



Nhờ vào ngoại lực



Hấp thu, phân chia



Cột



HPLC



Nhờ vào ngoại lực



Hấp thu, phân chia, trao đổi

ion, lọc gel



2.4.3. Sắc ký cột

2.4.3.1. Khái niệm

Sắc ký cột cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt

dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa, dụng cụ này giống cái buret để

định phân trong phòng thí nghiệm. Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống trụ. Mẫu cần tách

được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh. Pha động là dung mơi được rót liên tục vào đầu cột.

nhờ trọng lực dung môi di chuyển từ trên đầu cột xuống dưới cột, xuyên ngang qua pha

tĩnh, rồi ra khỏi cột và được hứng trong những ống nghiệm, mỗi ống nghiệm với một thể

tích như nhau. Nhờ thiết bị thu nhận mẫu tự động có thể hoạt động trong một thời gian

dài, người ta có thể triển khai sắc ký cột qua đêm rất thuận tiện. Như vậy, dung môi chảy

từ trên xuống sẽ kéo theo những phân tử thích hợp làm chúng tách ra khỏi hỗn hợp. Tóm

lại, yếu tố quyết định đến hiệu quả của sắc ký cột phụ thuộc vào việc lựa chọn pha động,

độ đặc khít của cột, dung mơi sử dụng, tốc độ giải ly… nên cần phải lưu ý chúng.[9]

2.4.3.2. Nguyên tắc và yêu cầu của phương pháp

Nguyên lý tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc kí khác: một mẫu thử được

nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxyt). Cột chứa chất hấp

phụ này đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc

theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác

16



nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng bị dung mơi giải

hấp và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau tạo các dãy riêng biệt có vị trí khác nhau ra khỏi

cột tại các thời điểm khác nhau, làm cơ sở cho việc phân tích định tính và định lượng.

2.4.3.3. Ưu nhược điểm của phương pháp

• Ưu điểm:

Có thể được sử dụng trong cả hai lĩnh vực phân tích và điều chế.

Sắc ký cột không những dùng để xác định số lượng các thành phần của một hỗn hợp mà

nó còn có thể được dùng để tách và tinh chế những thành phần phân tích. Điều này trái ngược với

sắc ký giấy, đó chỉ là một phương pháp phân tích.

Pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm; có thể triển khai với một lượng lớn

mẫu chất.



• Nhược điểm:

Khi chạy cột sắc ký cần đòi hỏi sự chú ý theo dõi liên tục để duy trì mức dung mơi

vì nếu khơng sẽ dễ gây xuất hiện các bọt khí làm tắc cột, nứt cột, và biến dạng đường đi

của dung môi.

Chạy cột tốn thời gian và và công việc lặp đi lặp lại, đặc biệt là khi chạy các mẫu

lớn.

Quá trình tách chậm và hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp.

2.4.3.4. Ứng dụng

Phân lập các hormon tăng trưởng steroid, hormon sinh dục và các hợp chất liên

quan.

Rửa giải các thuốc trừ sâu, tách các thuốc trừ sâu gốc Clo.

Phân lập kháng sinh, tách các chất lipid, phân lập alkaloid.

Tách các hợp chất chứa nito từ các hydrocarbon, làm tinh khiết dược liệu.

Tách hợp chất vòng thơm từ hỗn hợp mạch thẳng-vòng thơm, phân tích các

vitamin, khử màu dầu, chất béo và sáp bằng phương pháp thấm lọc...

2.4.4. Sắc ký lớp mỏng[9]

2.4.4.1. Khái niệm



17



Sắc ký lớp mỏng còn đươc gọi là sắc ký phẳng (plannar chromatophy), dựa chủ

yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi,di

chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, ví dụ như: silicagel hoặc oxit

alumin.

Pha tĩnh này được trán thành một lớp mỏng đều, phủ lên một chất nền phẳng như

tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng

nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.

Để triển khai sắc ký bản mỏng :

Bình sắc ký: là chậu, hũ, lọ…bằng thủy tinh, nhiều kích cỡ và hình dạng, có nắp

đậy dùng để giải ly bản mỏng.

Pha tĩnh : là một lớp mỏng khoảng



0,25 mm của một loại chất hấp thụ như



silicagel, alumin.

Pha động: là một loại dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chậm dọc

theo tấm sắc ký lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Vận tốc di chuyển dung mơi

tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại

pha tĩnh (hiện tượng hấp thụ của pha tĩnh ) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong

dung mơi.

Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực

khác. Sử dụng khoảng 1 microlit (1µL) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ

một ống vi quản để chấm mẫu thành một điểm (vết) gọn trên pha tĩnh, ở vị trí cao hơn

một chút so với mặt thống của dung mơi đang chứa trong bình.

Để quá trình sắc ký lớp mỏng đạt kết quả tốt, ta thấy cần phải lưu ý một số điểm

như sau: khi chấm mẫu không được để vết chấm loang quá rộng, không chấm quá nhiều

mẫu lên bản mỏng, phải sấy khơ bản mỏng trước khi giải ly. Bình (hay cốc) giải ly phải

được bão hòa dung mơi, phải che kín để dung môi tránh bị bay hơi, làm sai lệch tỷ lệ,

quan sát quá trình giải ly để biết các vết chấm có tách hay khơng.



18



Nắp đậy bình sắc ký

Pha tĩnh (chất hấp

thu)

Tấm bảng mỏng bằng plastic

hoặc nhôm



Mẫu cần phân tích



Pha động (dung mơi)



Hình 2.4: Bình triển khai sắc ký bản mỏng

2.4.4.2. Nguyên tắc:

Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được

di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta

thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ,

phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy

thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf

được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của

dung mơi:



Trong đó:

a: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.

b: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung mơi đo trên cùng đường đi của

vết, tính bằng cm.

Rf : Chỉ có giá trị từ 0 đến l.



19



Mức tiền tuyến dung mơi



b



a

Mức xuất phát



Hình 2.5: Sơ đồ thể hiện cách xác định a, b và Rf

2.4.4.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp

• Ưu điểm:

Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích.

Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện

phân tích.

Tất cả các hợp chát trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp

mỏng.

Quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết

quả mẫu cần phân tích.

2.4.4.4. Ứng dụng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đơi khi để

bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc...

2.5.



Tổng quan và phương pháp loại bỏ chlo và các dẫn xuất của chlo hiện nay



2.5.1. Tổng quan về chlo và dẫn xuất chlo

Chlo là một hợp chất quyết định trong sự phát triển và trao đổi chất của thực vật và

chlo luôn ln hiện diện ở mức độ ít trong hạt có dầu. Nếu chlo hiện diện với nồng độ đủ

lớn, Chlo sẽ có màu hơi lục trong dầu thơ. Chlo bị phân hủy nhiệt tạo thành sắc tố pheo,

sắc tố này làm dầu có màu tối.[16]



20