Thẩm định quy trình phân tích HPLC
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.62 MB, 101 trang )
Tính chọn lọc là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi
có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Phương
pháp HPLC được coi là có tính chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu:
1) Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý
nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn.
2) Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong
khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.
b. Tính tuyến tính và khoảng nồng độ
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hay
chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong mẫu thử. Khoảng tuyến tính là
khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng
tuyến tính.
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b
với hệ số tương quan tuyến tính r.
Đường chuẩn phải thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Đường chuẩn phải có ít nhất 5 mức nồng độ;
- Nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn phải bao phủ khoảng
xác định của phương pháp;
- Các mẫu chuẩn có thể được chuẩn bị bằng cách pha loãng một mẫu chuẩn
ban đầu hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau;
- Một quy trình HPLC thông thường dùng định lượng phải có hệ số tương
quan tuyến tính của đường chuẩn r ≥ 0,999.
c. Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy
trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng
21
giá trị RSD (%). Độ chính xác bao gồm độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ
tái lặp.
Độ lặp lại của phương pháp được biểu thị bằng giá trị RSD% kết quả phân
tích các mẫu độc lập trong cùng một điều kiện phân tích. Trong thực tế, thường
bố trí thí nghiệm xác định độ lặp lại của phương pháp cùng với thí nghiệm đánh
giá độ đúng của phương pháp, tuy nhiên, trong một số trường hợp, có thể chấp
nhận đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên các mẫu độc lập có nồng độ
tương ứng với 100% giá trị ghi nhãn.
d. Độ đúng
Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực
của mẫu đã biết.
Không có các giới hạn cụ thể mà độ đúng của một phương pháp phải đạt
được, giới hạn độ đúng của phương pháp còn phụ thuộc vào tỷ lệ % và/ hoặc
khối lượng chất cần phân tích có trong mẫu thử.
Độ đúng thường được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn. Thêm chất
chuẩn chất cần phân tích đã biết hàm lượng vào mẫu giả dược. Phân tích mẫu
theo qui trình phân tích. Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất của phương pháp (giá
trị trung bình và RSD). Trong một số trường hợp, không thể có được các mẫu
giả dược phù hợp, có thể chấp nhận thêm chất chuẩn chất cần phân tích đã biết
hàm lượng vào mẫu thử. Lượng chất chuẩn thêm vào không nên quá 50%
lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng lượng hoạt chất có trong mẫu phải nằm trong
khoảng tuyển tính của phương pháp. Tiến hành xác định độ đúng của phương
pháp tương tự như trường hợp thêm chuẩn vào mẫu giả dược.
22
CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên vật liệu
Chất đối chiếu: Acid oleanolic, Tokyo Chemical Industry Company, hàm
lượng 98,8%, độ ẩm 2,3%.
Dung môi, hóa chất:
- MeOH, HCl, CHCl3 đạt tiêu chuẩn thuốc thử phân tích (AR), Trung
Quốc
- MeCN loại HPLC của Merck - Đức
- H3PO4 loại HPLC của BDH, Anh
- Nước cất 2 lần
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Hệ thống máy HPLC Agilent Technologies 1260 Infinitive, Mỹ
Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức
Máy lắc xoáy Labinco L46, Hà Lan
Máy ly tâm Hettich, Đức
Cân độ ẩm Precciasa XM60 (Thụy Sĩ)
Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 μm.
Cân phân tích d = 0,1 mg Mettler Toledo, Thụy Sỹ
Bộ sinh hàn hồi lưu và bình cầu
Nồi đun cách thủy
Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong,…
23
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
Dược liệu đinh lăng được thu hái từ các vùng khác nhau của ba tỉnh Hòa
Bình (4 mẫu), Nam Định (12 mẫu) và Đắcknông (3 mẫu) và cao khô đinh lăng
thu hái ở Hòa Bình (1 mẫu), Nam Định (5 mẫu) được bào chế bằng phương pháp
phun sấy do Công ty Traphaco cung cấp.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng quy trình định lượng acid oleanolic trong dược liệu đinh
lăng và cao khô đinh lăng bằng phương pháp HPLC
Quy trình chiết tách: Khảo sát một số quy trình chiết tách sapogenin để từ
đó lựa chọn và xây dựng một quy trình chiết tách acid oleanolic phù hợp
với yêu cầu phân tích.
Lựa chọn điều kiện sắc ký: Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký phù
hợp để phân tích acid oleanolic có trong mẫu như:
- Cột sắc ký
- Thành phần, tỷ lệ, tốc độ pha động
- Detector
- Thể tích tiêm mẫu
2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp phân tích đã được lựa chọn với các chỉ tiêu: Độ
chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, độ
ổn định của dung dịch chuẩn.
2.2.3. Ứng dụng
Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định tính, định lượng acid oleanolic
trong một số mẫu dược liệu đinh lăng và cao khô đinh lăng.
24
